CA2、CA9蛋白在舌鳞状细胞癌的表达及预后价值

肖巧玲　祖木热提古丽?阿不来提　赵格　徐江　黎昌学

摘要：目的 探討CA2、CA9蛋白在舌鳞状细胞癌（TSCC）中的表达及生存意义，并分析两者表达相关性及在癌症中的潜在机制。方法 UCSC Xena在线分析CA2、CA9 mRNA在TSCC和对应正常组织中的表达，免疫组化验证CA2、CA9蛋白在89例TSCC及29例癌旁正常组织中的表达，并分析CA2、CA9蛋白表达相关性及其与临床因素相关性，同时研究了CA2、CA9对TSCC的诊断及生存意义。最后用STRING和Metascape数据库进一步探索了CA2和CA9蛋白潜在作用机制。结果 与癌旁正常组织相比，UCSC Xena数据库显示CA2、CA9 mRNA在TSCC中均高表达（均P<0.05），同时免疫组化实验表明CA2、CA9蛋白在TSCC中也显著高表达（均P<0.05）。其中，CA2蛋白在TSCC中高表达率为21.35%，CA9高表达率达61.80%。CA2蛋白高表达与TSCC更好的分化程度相关（P<0.05），CA9过度表达与更差的T分期明显相关（P<0.05），且CA2与CA9蛋白表达呈正相关（r=0.240， P<0.05）。CA2、CA9蛋白在TSCC中的ROC曲线下面积分别为83.9%、85.8%，且两者过度表达均与患者的不良预后相关（均P<0.05）。COX多因素模型提示CA9过度表达可能是TSCC预后不良的独立因素（HR：2.748， P<0.05）。CA2、CA9可能参与了调节pH、缺氧反应等生物过程。结论 CA2、CA9蛋白高表达提示TSCC患者的预后不良。

关键词：舌鳞状细胞癌；CA2；CA9；诊断；预后

中图分类号：R739.86中图分类号文献标志码：A文献标识码

Expression and prognostic value of CA2 and CA9 proteins in tongue squamous

cell carcinoma

XIAO  Qiaoling1，ABULAITI·Zumuretiguli1，ZHAO  Ge2，XU  Jiang3，LI  Changxue3*

（1 School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000，China; 2 Yantai Stomatological Hospital， Yantai，Shandong

264008， China; 3 The First Affiliated Hospital， School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000， China）

Abstract： Objective To investigate the expression and survival significance of CA2 and CA9 protein in TSCC （tongue squamous cell carcinoma， TSCC）， and to analyze the correlation between the expression of CA2 and CA9 proteins and their potential mechanisms in cancer. Methods UCSC Xena analyzed the expression of CA2 and CA9 mRNA in TSCC and corresponding normal tissues. Then we detected the expression of CA2 and CA9 proteins in 89 cases of TSCC and 29 cases of normal tissues adjacent to cancer by immunohistochemistry and analyzed the correlation between CA2 and CA9 protein expression and clinical factors. Meanwhile， we studied the significance of CA2 and CA9 in the diagnosis and survival of TSCC. Finally， the potential mechanisms of CA2 and CA9 proteins were further explored using STRING and Metascape databases.Results Compared with normal adjacent tissues， CA2 and CA9 mRNA were highly expressed in TSCC by UCSC Xena database （both P<0.05）， and immunohistochemical experiments indicated that CA2 and CA9 protein were also significantly higher in TSCC （both P<0.05）. The high expression rate of CA2 and CA9 protein in TSCC was 21.35% and 61.80%， respectively. In TSCC， the high expression of CA2 protein was correlated with the better differentiation （P<0.05）， the overexpression of CA9 was significantly related to the worse T-stage （P<0.05）. The results showed the expression of CA2 was positively correlated with CA9 in TSCC （r=0.240， P<0.05）. The area under ROC curved of CA2 and CA9 of TSCC was 83.9%and 85.8%， respectively. And the overexpression of CA2 and CA9 was correlated with poor prognosis of patients （both P<0.05） in TSCC.COX multivariate model suggested that CA9 overexpression might be an independent factor of poor prognosis of TSCC （HR：2.748， P<0.05）. Furthermore， CA2 and CA9 might be involved in biological processes such as pH regulation and hypoxia response.Conclusion High expression of CA2 and CA9 protein suggested poor prognosis of TSCC patients.

Key words： tongue squamous cell carcinoma;CA2;CA9;diagnosis;prognosis

口腔癌约占恶性肿瘤的3%［1］，其中90%是鳞状细胞癌，而舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）高达50%～60%［2］。TSCC的发病率和死亡率较高，5年生存率仅为50%［2］，因此寻求有效的生物标记物改善TSCC患者的预后和治疗很有必要性。

碳酸酐酶（carbonic anhydrases，CAs）是一种锌蛋白酶家族，目前在人类中已经发现15种亚型，它们具有不同的序列，却有相似的3D结构［3］。根据细胞定位主要分为胞质、膜结合、线粒体及分泌相关同工酶，其中，CA2属于胞质型，CA9属于膜结合型。碳酸酐酶主要参与人体二氧化碳與碳酸氢根之间的转化、pH调节、糖异生、钙化等生理过程，同样也在青光眼、肥胖、溶血性贫血及肿瘤等病理过程中发挥重要作用［4］。研究发现CA2表达与结直肠癌的侵袭性相关［3］，也会影响脑膜瘤的增殖［5］。CA9促进多种癌症发生发展，可能通过调控上皮间质转化相关分子表达来增加肝癌恶性并影响预后［6］，同时也是肾透明细胞癌、乳腺癌的治疗靶点［4，7］。

目前，关于CA9在口腔鳞状细胞癌中的表达已有初步研究，但CA2的表达水平仍缺乏探索。本研究拟通过免疫组化实验和生物信息学数据分析CA2、CA9在TSCC中的潜在表达机制与临床应用价值，并初步探索两者之间的相关性，以期为TSCC新的诊断治疗靶点提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 患者和样本

收集来自2004年至2020年石河子大学医学院第一附属医院口腔颌面外科手术切除的89例原发TSCC患者的石蜡标本，并选取29例对应的癌旁正常组织作为对照组。整理所有病例的临床病理资料，并参照第8版AJCC（the American Joint Committee on Cancer，AJCC）TNM分期标准进行临床分期。通过病历、电话和其他方法对患者进行随访，截止日期为2021年07月31日或死亡日期。

1.2 免疫组化

免疫组化采用EnVision两步法，切片在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各脱蜡5 min，然后在90%、80%、70%无水乙醇中再水合，加入一抗（稀释比例：CA2∶1∶200;CA9∶1∶200）在4℃下孵育过夜，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤切片组织，并使用EnVision TM 37℃温箱孵育30 min，用二氨基联苯胺（DAB）显色观察，样本用苏木精复染，再用酒精和二甲苯脱水封片。

1.3 评分标准

两名病理学家采用独立双盲法完成免疫组化染色评分，CA2、CA9染色结果分别以胞浆、胞膜出现棕黄色颗粒为阳性，并通过阳性细胞所占面积和染色强度两者计分乘积来判断。（1）阳性细胞面积百分比：＜5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。（2）细胞着色强度：无着色、黄色、棕黄色、棕色分别为0、1、2、3分。≤7分为低表达，8～12分为高表达。

1.4 生物信息学数据

UCSC Xena（https：//xenabrowser.net/）是由TCGA数据库衍生的一个非常直观的在线网站。本研究筛选条件：数据来源：TCGA Head and Neck Cancer（HNSC）数据集；基因表达RNAseq：llluminaHiSeq；解剖部位：舌和舌根；组织学类型：鳞状细胞癌；样本类型：原发肿瘤。最终筛选出155例原发TSCC组织和对应的15例正常组织。

SRTING数据库（https：//cn.string-db.org/）是一个可以基于单个或多个蛋白预测其可能蛋白网络的在线网站。本研究筛选条件：最低置信度得分：中等可信度（0.400）。

Metascape（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）是一个专注于基因功能注释和富集通路分析的网站。分析条件：个性化分析；最小重叠区域：3；最小富集：1.5；P值截点：0.01；富集分析：分子功能、生物功能和细胞成分GO分析及KEGG通路分析。

1.5 统计

使用SPSS软件23.0版进行统计学分析。用χ2检验评估CA2、CA9在TSCC中的表达及其与临床病理因素的相关性。Spearman分析CA2与CA9表达的相关性并绘制散点图。ROC曲线评估CA2、CA9对TSCC的免疫诊断价值，Kaplan-Meier分析绘制存活曲线，COX单因素及多因素模型评估CA2、CA9对TSCC的生存影响。生物信息学数据均采用在线统计分析，P＜0.05认为差异有统计学意义（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000）。

2 结果

2.1 CA2、CA9 mRNA和蛋白在TSCC中的表达

利用UCSC Xena在线数据库的TCGA数据集筛选出TSCC样本后分析CA2、CA9 mRNA的表达。结果显示，与正常组织相比，CA2、CA9 mRNA在TSCC中均表现出高表达（P<0.001;P<0.000），结果见图1。

免疫组化结果表明，CA2、CA9蛋白在TSCC中的表达水平都高于癌旁正常组织（P=0.015，P<0.000），CA2主要定位于细胞浆，CA9定位于细胞膜（图2）。其中，CA2在TSCC中高表达率为21.35%，CA9在TSCC中高表达率占61.80%，结果见表1。

2.2 CA2、CA9蛋白与TSCC临床因素相关性

TSCC中，CA2蛋白过度表达与较好的分化程度显著相关（P=0.027），结果见图3，与患者年龄、性别、淋巴转移、T及TNM分期无明显相关；CA9蛋白高表达与更差的T分期明显相关（P=0.018），而与年龄、性别、淋巴转移、TNM分期和分化程度无相关性，结果见表2。

2.3 TSCC中，CA2与CA9蛋白表达的相关性分析

同时，根据免疫组织化学评分结果，Spearman分析表明，CA2与CA9蛋白表达水平在TSCC中呈正相关，且有统计学意义（r=0.240，P=0.023），结果见图4。

2.4 CA2、CA9蛋白与TSCC的ROC曲线

接着，利用ROC曲线评估CA2、CA9蛋白对TSCC患者的免疫组化诊断价值。CA2、CA9蛋白在TSCC中的ROC曲线下面积分别为83.9%、85.8%。同时根据约登指数最大值得出CA2的敏感度为77.5%，特异性为79.3%，CA9的敏感度和特异性分别为87.6%和75.9%，结果见图5。

2.5 CA2、CA9蛋白與TSCC患者的预后分析

进一步研究CA2、CA9蛋白表达对TSCC患者的预后影响。89例TSCC患者中，71例获得随访信息。对71例TSCC患者进行Kaplan-Meier分析，结果表明CA2高表达预测了TSCC患者更低的生存率（P=0.023），同时，CA9蛋白过度表达也与TSCC更短的生存率显著相关（P=0.005），结果见图6。

建立CA2、CA9蛋白及TSCC临床病理因素的COX单因素、多因素模型，如图7所示。

COX单因素回归模型显示CA2、CA9蛋白表达及T分期的增加均是TSCC患者预后差的重要影响因素（风险比（hazard ratio，HR）：2.353，P= 0.027;HR：2.866，P=0.008；HR：5.139，P=0.000）。COX多因素分析表明CA9蛋白过度表达及T分期增加是TSCC患者预后不良的独立影响因素（HR：2.748，P=0.030;HR：13.682，P=0.001）。

2.6 CA2和CA9蛋白网络图

基于STRING网站在线分析CA2、CA9人类相关蛋白网络图，筛选出前50个相关蛋白，CA2和CA9蛋白通过实验测定及文本数据挖掘表明两者存在关联，提示CA2、CA9存在蛋白同源性，并预测两者之间存在基因共表达，也再次验证了免疫组化分析的CA2与CA9蛋白之间明显相关的结论（图8）。

2.7 CA2、CA9富集通路分析

最后，Metascape数据库根据CA2、CA9和前50个相关蛋白进行通路富集分析。前20个GO分析表明，CA2和CA9主要位于外侧质膜中，两者主要参与了调节PH值和缺氧反应等生物过程，可能具备碳酸盐脱水酶活性等分子功能。前10个KEGG通路显示CA2和CA9主要参与了肾细胞癌、粘合连接等信号通路（图9）。

3 讨论

CAs可通过调节pH参与人类多种癌症的发生发展，且是多种疾病的标记物［3］。最近研究表明CA2在非小细胞肺癌中低表达［4］，在胶质母细胞瘤［8］、脊索瘤［9］中高表达，CA9在头颈部鳞癌、肝癌、乳腺癌等多种癌症中上调［4］。然而，鲜少有关于CA2、CA9在TSCC中的表达及预后意义的研究。本研究发现CA2、CA9蛋白在TSCC中的表达均高于正常组织，且两者蛋白表达水平呈正相关关系，提示CA2和CA9可能作为促癌基因共同参与TSCC的发展。

CA2位于染色体8q21.2上，是一种极其活跃的胞质相关同工酶，对CO2的周转率可接近扩散极限，并广泛分布于人体的大脑、肝、结直肠、肺、生殖器官等多种组织。Korhonen等［5］发现CA2高表达增加脑膜瘤的恶性程度，并与肿瘤分化程度相关。CA2在腹膜假性黏液瘤中高表达，且预示着患者的不良预后［10］，而Zhang等［11］学者提出相反的结论，认为高表达的CA2预示着肝癌患者较好的总体生存率。本研究发现CA2蛋白与TSCC分化程度相关，且CA2高表达是TSCC预后差的重要影响因素。浸润深度、肿瘤分级、侵入方式等都影响口腔鳞癌患者的预后，提示CA2过度表达是TSCC患者预后差的潜在标记物，CA2在不同组织来源的恶性肿瘤中发挥不同作用。此外，ROC曲线被广泛应用于评价医学诊断相关标记物，其中，AUC是评估诊断价值的重要指标［12］，CA2对TSCC的ROC曲线下面积为83.9%，提示CA2对TSCC免疫组化诊断存在一定价值，可作为潜在标记物。Becker等学者在爪蟾卵母细胞中发现CA2具有催化MCT1和MCT4等转运体的作用［13］，单羧酸转运体（monocarboxylate transporters，MCTs）可通过运输肿瘤微环境的代谢物发挥促瘤作用，高表达的MCT1和MCT4是头颈部鳞癌的功能性生物标记物［14］，CA2可能作为中介为MCT1、MCT4等多种转运体提供底物，从而导致微环境酸化［4］，而细胞外较低的pH与恶性肿瘤的侵袭与预后不良相关［3］。同时，基因谱分析表明CA2与结直肠癌的转移相关，可能机制是缺乏CA2可以保护肿瘤细胞免受pH值波动，保持细胞稳态［15］。本研究通过生物信息学预测CA2和CA9可能共同参与了调节pH值、缺氧反应等生物过程，因此，我们推测CA2在恶性肿瘤中通过调节pH发挥作用。

CA9位于染色体9p12-13上，是一种多结构域的膜结合同工酶，也是头颈部鳞癌、乳腺癌、前列腺等多种癌症的潜在标记物，目前已有有力证据表明CA9在缺氧条件下表达，调节肿瘤微环境的pH，从而促进肿瘤的发生、增殖、侵袭等恶性行为［4］。CA9在胰腺癌中与肿瘤大小呈正相关［16］，也有学者提出CA9与TSCC的T分期显著相关［17］，这与我们的研究结果一致。同时，本研究发现过度表达的CA9是影响患者预后不良的独立因素，一致的是，Smith等［18］也提出高表达的CA9与前列腺癌较差的预后有关，而Gu等［19］认为CA9的高表达预示胆管癌更好的预后。此外，CA9对TSCC的ROC曲线下面积为85.8%，提示CA9可作为TSCC免疫组化诊断的潜在标记物。低表达的E-cadherin是增加口腔鳞癌侵袭性的可靠指标，CA9可调节E-cadherin介导的细胞粘附能力从而增加恶性肿瘤细胞的侵袭性，提示CA9可能通过E-cadherin从而增加TSCC的侵袭能力［20］。酸化的微环境不利于免疫细胞和正常细胞的存活与发挥功能，但能促进癌细胞的生长。CA9可与Na+/HCO3-共转运体和阴离子交换器直接作用，催化细胞外环境中的CO2可逆水合作用，促使形成pH过低的肿瘤微环境，同时，CO2水化作用会导致酸挤压增强，进而增强癌细胞的pH缓冲活性与抗凋亡特征，并形成碱化的细胞内环境，此外，缺氧也会存在进而激活CA9，加重肿瘤微环境的酸化程度［21］。提示CA9可能通过参与调节pH、缺氧反应、增加细胞粘附促进恶性肿瘤的发展，这与我们通过生物信息学预测的一致。CA2和CA9在结构上具有相同的质子穿梭残基和锌配体，同源性约33%，两者之间可能通过阴离子交换蛋白致使肿瘤外环境酸中毒［22］。也有研究报道，CA2和CA9可能通过调节pH值促使细胞酸化而产生适合肿瘤生长的微环境［22］。提示CA2与CA9之间可能通过共同调节pH促进TSCC的发生发展。但是关于CA2和CA9在TSCC中的具体机制仍待进一步探索和实验验证。

綜上所述，CA2、CA9蛋白在TSCC中明显高表达，且两者表达呈正相关。CA2和CA9对TSCC具有良好的诊断价值，且与预后不良显著相关，提示CA2、CA9可能是TSCC患者潜在的预后标记物。CA2和CA9可能通过共同调节pH酸化肿瘤微环境发挥促癌作用，但目前仍需更多的样本验证其临床研究价值及潜在表达机制。

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（责任编辑：编辑唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-05-27

基金项目：国家自然科学基金项目（82160572）;新疆维吾尔自治区研究生科研创新项目（XJ2020G102）

作者简介：肖巧玲（1996—），女，硕士研究生，专业方向为口腔頜面外科。

*通信作者：黎昌学（1969—），男，主任医师，从事口腔颌面部肿瘤治疗研究，e-mail：lichangxue100@163.com。