术中快速与术后常规免疫组织化学染色效果比较

[摘" "要]" "目的：探讨术中冷冻切片快速免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）技术在术中快速病理诊断中的应用效果。方法：对17例术中常见送检的乳腺、肺、甲状腺病变标本应用术中冷冻切片快速免疫组织化学技术检测广谱细胞角蛋白（Cytokeratin Pan，CKpan）、细胞角蛋白5/6（Cytokeratin 5/6，CK5/6）、细胞角蛋白19（Cytokeratin 19，CK19）、甲状腺转录因子-1（thyriod transcription factor-1，TTF-1）和P63蛋白的表达，并与术后常规免疫组织化学染色效果进行比较。结果：术中冷冻切片快速IHC与术后常规IHC对CKpan、CK5/6、CK19和TTF-1蛋白的染色部位一致，染色强度相似。结论：术中快速免疫组织化学技术对常见阳性标志物的染色效果与常规免疫组织化学技术接近。

[关键词]" "术中标本；病理诊断；快速免疫组织化学；染色效果

[中图分类号]" "Q816 [文献标志码]" "A [DOI]" "10.19767/j.cnki.32-1412.2024.05.003

Comparison of the staining effect of intraoperative rapid immunohistochemistry and postoperative routine immunohistochemistry

WANG Wei， HE Xin， ZHANG Shu

（Department of Pathology， the Affiliated Hospital of Nantong University， Jiangsu 226001）

[Abstract]" "Objective： To investigate the effect of intraoperative frozen section rapid immunohistochemistry in rapid pathological diagnosis during surgery. Methods： The expression of Cytokeratin Pan（CKpan）， Cytokeratin 5/6（CK5/6）， Cytokeratin 19（CK19）， thyriod transcription factor-1（TTF-1） and P63 protein in 17 cases of breast， lung and thyroid specimens was detected by intraoperative frozen section rapid immunohistochemistry， and the results were compared with postoperative routine immunohistochemistry staining. Results： Through comprehensive comparative analysis， it was found that the staining sites of CKpan， CK5/6， CK19， and TTF-1 were consistent during and after surgery， and the staining intensity was also similar. Conclusion： The staining effect of intraoperative rapid immunohistochemistry on common positive expression markers is similar to that of routine immunohistochemistry staining.

[Key words]" "intraoperative specimen; pathological diagnosis; rapid immunohistochemistry; dyeing effect

术中冷冻切片快速免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）技术是新的检测手段，国内已开始逐渐普及，其特点为检测准确、方便、快捷，可以辅助术中快速鉴别肿瘤的良恶性以及是否转移等，提高病理诊断准确率。本研究选取我院2024年2月—5月术中常见送检的乳腺、肺及甲状腺病变标本17例，探讨术中冷冻切片快速IHC在术中病理诊断的应用效果。

１" "材料与方法

1.1" "标本" "术中常见送检的病变标本17例，其中乳腺病变8例、肺病变6例、甲状腺病变3例，均行术中冷冻切片快速IHC及术后常规IHC染色。

1.2" "试剂" "术中冷冻切片快速IHC染色两步法专用一抗CKpan（AE1/AE3）、CK5/6（C6H1/C1C8）、P63（C2C10）、CK19（A53-B/A2.26）、TTF-1（SPT24），快速IHC染色配套固定液，专用酶标聚合物二抗，均购自河南赛诺特生物公司。石蜡包埋组织切片使用IHC一抗CKpan（AE1/AE3）、CK5/6（RM341）、CK19（UMAB2）、TTF-1（SPT24），高敏型酶标抗鼠/兔IgG聚合物二抗，intellip ATH Plus DAB染色液（批号249022），均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3" "方法

1.3.1" "术中冷冻切片快速IHC染色：冷冻组织使用冷冻切片机连续4 μm厚切片，专用固定液固定30 s，清洗液洗２次，通用免疫组化封闭液封闭20 s，专用一抗孵育4 min，清洗液洗２次，二抗３ min；清洗液洗２次，DAB工作液90 s（DAB底物：缓冲液＝1∶20），清洗液洗２次，苏木精复染10 s，水洗后脱水、透明、中性树脂封固（操作时室温控制在20～25 ℃）。

1.3.2" "常规IHC染色：利用Ultra PATH 60全自动免疫组化仪进行免疫组化检测。手术切除的组织标本经中性福尔马林液固定，脱水，石蜡包埋，4 μm厚连续石蜡切片。脱蜡，PBS水洗，抗原修复缓冲液（pＨ9.0）进行抗原修复20 min，使用H2O2除去内源性过氧化物酶，室温下孵育300 s，PBS水洗。切片上滴加一抗，室温下孵育30 min，PBS水洗，滴加增强剂900 s，PBS水洗。滴加高敏型酶标抗鼠/兔IgG聚合物二抗试剂，室温下孵育1 000 s，PBS水洗。滴加新鲜配制的DAB显色试剂，水洗终止显色，苏木精复染，PBS返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4" "结果判读" "比较术中冷冻切片快速IHC和术后常规IHC的染色效果。CKpan表达定位于细胞质、CK5/6表达定位于细胞质、P63表达定位于细胞核、CK19表达定位于细胞质、TTF-1表达定位于细胞核，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色黄色为阳性。

２" "结" " " 果

2.1" "术中冷冻切片快速IHC有效性的初步验证" "在乳腺组织冷冻切片中（图1A），相较于95%乙醇固定标本（图1B），使用术中冷冻切片快速IHC染色配套固定液染色效果有所改善（图1C），导管周边肌上皮细胞P63核染色效果增强，表现为棕黄色颗粒显色更深，更易于病理医生的观察。

2.2" "使用快速染色配套固定液的术中快速IHC与术后常规IHC结果比较

2.2.1" "乳腺病变标本：8例手术切除的乳腺病变标本经常规IHC染色，其中1例病理诊断为少见的腺病伴大汗腺化生，1例诊断为恶性病变。1例腺病伴大汗腺化生在术中行快速冰冻切片HE染色，镜下见乳腺上皮增生（图2A），加做CK5/6 IHC后，显示导管周围肌上皮细胞CK5/6阳性，导管上皮CK5/6阴性，符合乳腺腺病伴导管上皮及肌上皮增生，诊断为腺肌上皮瘤可能，伴部分导管上皮大汗腺化生。术中冷冻切片快速IHC镜下能更好观察侵及范围（图2B），且与术后IHC结果一致（图2C）。

另1例恶性病变，术中快速冰冻切片HE染色镜下见乳腺上皮实性、筛状增生，细胞异型，与巢团状浸润性癌无法鉴别（图3A），加做CK5/6 IHC，显示巢周肌上皮细胞存在，巢内无肌上皮细胞（图 3B），提示病变为原位癌，与术后常规IHC结果一致（图3C）。

2.2.2" "肺病变标本：6例手术切除的肺病变标本经常规IHC染色，其中1例病理诊断为恶性病变。该例术中快速冰冻切片HE染色，镜下可见病灶内浸润性生长的高度异型细胞，无法鉴别低分化癌或恶性间皮瘤（图4A、D），加做TTF-1、CKpan IHC，提示为低分化腺癌（图4B、E），与术后常规IHC的结果一致（图4C、F）。

2.2.3" "甲状腺病变标本：3例手术切除的甲状腺病变标本经常规IHC染色，其中1例诊断为恶性病变。该例术中快速冰冻切片HE染色，镜下表现为滤泡上皮乳头状结构（图5A）。加做CK19 IHC，显示CK19强阳性，提示乳头状癌可能（图5B），与术后常规IHC结果一致（图5C）。

3" "讨" " " 论

本研究选取术中常见送检的乳腺、肺、甲状腺病变标本，比较术中冷冻切片快速IHC与术后常规IHC对CKpan、CK5/6、P63、CK19和TTF-1的染色情况。结果显示，两者染色强度相似，标记部位一致，非特异性背景着色弱。术中快速IHC染色方法简单实用，流程总耗时10～12 min，可操作性强。由于使用改良的固定液、清洗液和特异性高、灵敏性强的一抗，使得抗原抗体亲和力高，背景干净，且新鲜组织抗原完整无破坏，切片中靶蛋白更易显色，可在术中高效精准识别病灶和病理分型，发现微小转移灶、浸润灶，降低假阴性率，降低仅靠HE染色发生误诊的风险。

术中快速病理检查对手术方案的决策具有关键性作用，通常要求病理医师在30分钟内提供正确的病理诊断信息，但组织在冷冻时不可避免形成冰晶，对细胞和组织形态产生破坏。对于形态学不典型、术前检查与术中良恶性指征不符的患者以及微小转移灶，病理医师难以在短时间内根据HE染色作出准确诊断。IHC技术在临床病理诊断中不可或缺，广泛用于疑难肿瘤的诊断和鉴别诊断、肿瘤组织来源的判断、预后评估以及靶向药物适用病例的筛选等。然而常规IHC操作过程大多需要3小时以上，耗时较长，无法满足术中快速病理诊断需要。近年来，术中快速IHC技术的临床应用逐渐增多，由于操作简单、快捷，可提高术中病理诊断的准确性，降低误诊风险[1]。

CK蛋白及其家族成员蛋白表达水平在乳腺肿瘤来源、手术切缘、淋巴结转移的识别中具有重要意义，可通过肌上皮细胞标记CK5/6判断有无浸润。术中前哨淋巴结凭HE染色无法鉴别淋巴结癌转移，CKpan可标识单个或成团转移性癌细胞，更准确判断淋巴结是否被癌细胞浸润。快速IHC技术检测CKpan、CK5/6和P63在判断乳腺肿瘤原位癌或浸润性癌及前哨淋巴结微转移中已取得较好效果[2-3]。CK19在甲状腺肿瘤原位癌或浸润性癌中表达明显升高，可鉴别乳头状增生和乳头状癌，CK19阳性表达联合镜下组织学特点有助于甲状腺病变的手术决策[4]。TTF-1蛋白是一种转录调控因子，在肺腺癌、小细胞肺癌和大多数甲状腺癌中表达[5]，是术中诊断肺腺癌最常用的标志物。

然而，关于术中快速IHC技术还有一些值得思考的问题：（1）不同组织标本如何精准选用合适的抗体指标。（2）需要建立术中快速IHC染色操作流程，有效控制病理诊断时长。（3）需要标准化质控，如冷冻切片厚度、冷冻时间长短、如何避免组织中冰晶等影响因素[6]。

综上所述，术中冷冻切片快速IHC与术后常规IHC的染色效果相似，在常规术中冷冻切片HE染色不能诊断时，建议作快速IHC染色以提高术中病理诊断的准确性，降低延迟诊断率。

[参考文献]

[1] 郑波，邹霜梅，杨琳，等. 直接免疫组织化学染色在术中冷冻切片细支气管腺瘤辅助诊断中的应用价值［J］. 中华病理学杂志，2023，52（2）：142-146.

[2] 刘梅，李席如，宋欣，等. 术中快速直接免疫组化在乳腺病变和前哨淋巴结诊断中的应用［J］. 诊断病理学杂志，2018，25（3）：170-176.

[3] 孔静萍，周浩杰. 快速免疫组化技术检测CK5/6和P63在乳腺肿瘤冰冻切片诊断中的应用［J］. 现代实用医学，2013，25（6）：659-661.

[4] PYO J Y，CHOI S E，SHIN E，et al. The intraoperative immunohistochemical staining of CD56 and CK19 improves surgical decision for thyroid follicular lesions［J］. J Pathol Transl Med，2017，51（5）：463-470.

[5] KHIDIR L S，ABDELWADOUD M E，ABDELMOLA A，et al. The role of thyroid transcription factor-1 in differentiating lung adenocarcinomas from non-pulmonary adenocarcinoma effusions［J］. J Med Life，2023，16（6）：932-936.

[6] 高少阳，王明伟，张盛，等. 建立优化的术中快速免疫组化检测体系［J］. 临床与实验病理学杂志，2021，37（1）：108-109.

[收稿日期] 2024-08-20

（本文编辑" "缪宏建）