ARHGAP8在中低位局部进展期直肠癌新辅助化疗疗效预测中的应用

摘要：目的 分析ARHGAP8对中低位局部进展期直肠癌新辅助化疗疗效预测的敏感性，为进展期直肠癌的治疗提供精准依据。方法 通过生物信息学分析筛选，获得差异基因ARHGAP8。选取68例原发性直肠癌患者的直肠癌组织及直肠组织标本，应用实时荧光定量PCR、Western blot和免疫组织化学方法分别对ARHGAP8的表达强度进行验证，并收集患者性别、年龄、分期、肿瘤大小、分化程度、病理类型等临床病理特征进行功能验证；选取44例行新辅助化疗的中低位局部进展期直肠癌患者，采用免疫组织化学方法检测新辅助化疗前后ARHGAP8的表达情况，分析ARHGAP8在新辅助化疗前后、不同疗效组之间的表达情况。结果 生物信息学结果显示，ARHGAP8在癌组织及直肠组织中的表达差异有统计学意义（P＜0.001），且ARHGAP8的表达水平与肿瘤分期（P=0.024）、淋巴结转移（P=0.007）、年龄（P=0.005）等临床特征相关。 实时荧光定量PCR结果显示，ARHGAP8 mRNA在癌组织中的表达显著高于直肠组织（P＜0.001）；Western blot和免疫组织化学结果显示，ARHGAP8蛋白在癌组织中的表达显著高于直肠组织（P=0.011）；ARHGAP8的表达与肿瘤大小（P=0.010）、病理分期（P=0.005）密切相关，而与肿瘤分化程度、淋巴结转移、肝转移、Ki-67、微卫星不稳定性的表达程度无相关性。44例接受新辅助化疗的患者中TRG 0级13例、1级8例、2级8例、3级15例，其中65.91%（29/44）的患者新辅助化疗有效，新辅助化疗有效患者治疗后ARHGAP8的表达显著下降（P＜0.001），ARHGAP8蛋白低表达患者的有效率为92.86％，显著高于ARHGAP8蛋白高表达者（53.33％）（P=0.033）。结论 ARHGAP8在直肠癌组织中高表达，ARHGAP8低表达的中低位局部进展期直肠癌患者对XELOX方案新辅助化疗更为敏感，ARHGAP8可作为直肠癌发生发展的潜在生物学指标，同时可作为中低位局部进展期直肠癌XELOX方案新辅助化疗疗效评估的重要参考指标。

关键词：中低位局部进展期直肠癌；ARHGAP8；新辅助化疗；疗效评估；肿瘤退缩分级

中图分类号： R735.3+7" 文献标识码： A" 文章编号：1000-503X（2024）04-0528-11

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15899

Application of ARHGAP8 in Predicting the Efficacy of Neoadjuvant Chemotherapy for Locally Advanced Mid-Low Rectal Cancer

XI Yuning1，XUE Jun1，2，WU Xueliang1，2，QU Ming1，SUN Guangyuan1，HAN Lei1，GUO Fei1，ZHANG Chunze3，WANG Yifei1，LIANG Weizheng4

1Department of General Surgery，2Institute of Tumor，The First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei 075000，China

3Department of Anus and Intestine Surgery，People’s Hospital of Tianjin，Tianjin 300000，China

4Central Laboratory，The First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei 075000，China

Corresponding author：XUE Jun Tel：0313-8046911，E-mail：yfyxuejun@163.com

ABSTRACT：Objective To analyze the sensitivity of ARHGAP8 in predicting the efficacy of neoadjuvant chemotherapy in the patients with locally advanced mid-low colorectal cancer and provide accurate evidence for the treatment of advanced colorectal cancer.Methods The differentially expressed gene ARHGAP8 was screened out by bioinformatics analysis.Cancer tissue and rectal tissue of 68 patients with primary rectal cancer were selected.The rectal cancer tissue samples and the rectal tissue samples were collected for clinical validation of ARHGAP8 expression by quantitative real-time PCR，Western blotting，and immunohistochemistry.The clinical and pathological features such as gender，age，tumor stage，differentiation degree，and pathological type of the patients were collected for functional validation.Forty-four patients with locally advanced mid-low rectal cancer who received neoadjuvant chemotherapy were selected for immunohistochemical examination of ARHGAP8 expression.The expression level of ARHGAP8 was compared between before and after chemotherapy and among different efficacy groups.Results The bioinformatics analysis revealed differences in the expression level of ARHGAP8 between the cancer tissue and rectal tissue （Plt;0.001）.The expression level of ARHGAP8 was correlated with tumor stage （P=0.024），lymph node metastasis （P=0.007），and age （P=0.005）.Quantitative real-time PCR results showed that the mRNA level of ARHGAP8 in the cancer tissue was higher than that in the rectal tissue （Plt;0.001）.Western blotting and immunohistochemistry results demonstrated that the protein level of ARHGAP8 in the cancer tissue was higher than that in the rectal tissue （P=0.011）.The expression of ARHGAP8 was correlated with tumor size （P=0.010） and pathological stage （P=0.005），while it showed no significant association with tumor differentiation degree，lymph node metastasis，liver metastasis，Ki-67，or microsatellite instability expression level.The 44 patients receiving neoadjuvant chemotherapy included 13，8，8，and 15 patients of tumor regression grades 0，1，2，and 3，respectively.Among them，65.91% （29/44） patients showed responses to the treatment.After neoadjuvant chemotherapy，the expression of ARHGAP8 in the cancer tissue was down-regulated in the patients who responded to the chemotherapy （Plt;0.001）.The response rate in the patients with low protein level of ARHGAP8 was 92.86%，which was higher than that （53.33%） in the patients with high protein level of ARHGAP8 （P=0.033）.Conclusions ARHGAP8 is highly expressed in the rectal cancer tissue.The patients with locally advanced mid-low rectal cancer and low ARHGAP8 expression are more sensitive to neoadjuvant chemotherapy with the XELOX protocol.ARHGAP8 can serve as a potential biomarker for the occurrence and development of rectal cancer and an important index for evaluating the efficacy of neoadjuvant chemotherapy with the XELOX protocol in the patients with locally advanced mid-low rectal cancer.

Key words：locally advanced mid-low rectal cancer；ARHGAP8；neoadjuvant chemotherapy；efficacy evaluation；tumor regression grade

Acta Acad Med Sin，2024，46（4）：528-538

近年来，全球结直肠癌的发病率和病死率呈现逐年上升趋势［1］。据最新研究数据显示其发病率、病死率在恶性肿瘤中高居第2位［2］。局部进展期直肠癌（locally advanced rectal cancer，LARC）因其较高的复发率及远处转移率引起了国内外研究人员的广泛关注［3］。新辅助化疗［4］即新辅助化疗+全直肠系膜切除术+术后辅助化疗的“夹心饼”疗法近年被普遍运用于低位进展期直肠癌的治疗中［5］。有临床研究证实，新辅助化疗模式可显著提高进展期直肠癌的R0切除率，降低局部复发率［6］，是LARC治疗的重要手段［4］，其对于病变的治疗有重要作用。肿瘤退缩分级（tumor regression grade，TRG）作为评估新辅助化疗疗效的标准目前被学界广泛认可。然而，目前对预测直肠癌新辅助化疗疗效及预后影响的研究较少，且无明确的指南共识［4］。近年来，对于LARC患者新辅助化疗后反应的预测，逐步倾向于生物学标志物的检测，且在最新版的美国临床肿瘤学会指南中将分子生物学指标的检测作为LARC疗效的重要评估方式，从而为LARC治疗提供更为精准的依据［7］。

ARHGAP8是近年新发现的RHOGAP家族的新成员，它通过对结合了GTP的三聚体G蛋白及RHO家族蛋白发挥加速解离、抑制GTP结合的功能，从而发挥改变细胞信号转导的作用，其在乳腺癌与结直肠癌中有较高的表达，但具体的临床意义及相关作用机制尚不明确［8-10］。本研究旨在检测ARHGAP8在直肠癌组织中表达的特异性，分析其临床意义，并探讨ARHGAP8的表达与直肠癌新辅助化疗疗效的预测价值，从而为进展期直肠癌临床新辅助化疗疗效预测提供精准的参考依据。

1 资料和方法

1.1 临床病例收集

选取2021年8月至2023年5月河北北方学院附属第一医院普通外科行直肠癌切除术的68例患者，分别取癌灶中心组织及距肿瘤10 cm以上的直肠组织各2～5 g，并统计患者的临床资料（肿瘤分期、浸润深度、分化程度、Ki-67表达程度等）。本研究经河北北方学院附属第一医院伦理委员会批准（伦理审查编号：K2022058），且患者知情同意。纳入标准：（1）均经病理证实为直肠腺癌；（2）术前未行放化疗、生物、免疫等治疗。排除标准：（1）合并其他原发恶性肿瘤病史；（2）病例资料不完整；（3）拒绝参与本研究。

选取同期行新辅助化疗+手术治疗的44例中低位局部进展期直肠癌患者，并收集肠镜活检癌组织及术后癌组织病理蜡块，病理图片及化疗前后的肠镜、MRI影像学图片等资料。纳入标准：（1）病理证实为直肠腺癌；（2）术前评估为中低位局部进展期；（3）均为术前行XELOX方案新辅助化疗+根治性切除+术后行辅助化疗；（4）无远处转移；（5）病史资料齐全；（6）依从性好，自愿参与本研究。排除标准：（1）伴远处转移；（2）无法耐受化疗而中断。

1.2 生物信息学数据分析

UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/）是一个交互式门户网站，用于对TCGA基因表达数据的37种肿瘤进行深入分析，本研究用于比较ARHGAP8在直肠癌中的差异表达及ARHGAP8与直肠癌部分临床表型的关系。R语言maftools（版本 4.2.3）用于对肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）、微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）等数据进行相关分析。

1.3 实验设备与实验试剂

1.3.1 实验设备

实时荧光定量PCR仪（TL988）为西安天隆科技有限公司产品；恒温鼓风电热干燥箱（101-1AB）为天津市泰斯特仪器有限公司产品；数显恒温水浴锅（HH-2）、实验室高压蒸汽灭菌器（BKO-B50II）、液氮罐（YDS-10-125-F）均为山东博科生物产业有限公司产品；医用纯水机（SCSJ-II-60L）、台式高速冷冻离心机（TGL-16M）均为济南鑫贝西生物技术有限公司产品；自动切片机（KD-2258）、生物组织摊烤片机（目录号KD-T）均为浙江省科迪仪器设备有限公司产品；移液枪为美国TERMO公司产品；免疫组织化学湿盒为武汉三鹰生物技术有限公司产品；包埋机（目录号KD-BL111）、切片机（目录号KD-2258）均购自浙江省科迪仪器设备有限公司；LED荧光显微镜（目录号DM 2500）购自徕卡显微系统上海贸易有限公司；Mini AmpTM热循环仪（目录号A37834）、7500实时荧光定量PCR分析仪（目录号4351104）均购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.3.2 实验试剂

DAB显色液（目录号GB/T 601-2020）、DAB显色液（ZLI-9017）、辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG（目录号ZB-2306）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；10%中性缓冲福尔马林溶液（目录号BLC-01）为北京九州柏林生物科技有限公司产品；二甲苯（目录号X821391）、无水乙醇（目录号E809061）均为上海麦克林生化科技股份有限公司产品；柠檬酸钠抗原修复液（目录号C1031）、封闭山羊血清（目录号SL038）、抗原修复液（目录号C1031）、脱脂奶粉（目录号LP0033B）均购自北京索莱宝科技有限公司；1×PBS缓冲液（目录号P1020）、中性树胶（目录号ZLI-9555）均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；兔二步法试剂盒（目录号PV-6001）试剂1：内源性过氧化物酶阻断剂、试剂2：酶标山羊抗兔IgG聚合物均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；苏木精（目录号BS915）为Biosharp生物科技有限公司产品；ARHGAP8抗体购自Atlas antibodies公司；Hifair Ⅲ第1链cDNA 预混液（含gDNA 去除）逆转录试剂盒（目录号11139ES60）、实时荧光定量PCR扩增预混合液试剂盒（目录号11202ES50）均购自翌圣生物科技股份有限公司；细胞组织快速裂解液（目录号R0278）购自上海北诺生物科技公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（目录号（P2120）购自美国默克集团；Trizol试剂（目录号15596026）、PierceTM BCA蛋白质定量试剂盒（目录号23225）均购自赛默飞世尔科技有限公司；ARHGAP8 一抗（PA5-67065）购自英杰生命技术有限公司。

1.4 新辅助化疗流程

术前给予4周期XELOX方案化疗［11］（化疗日静脉滴注奥沙利铂130 mg/m2，化疗后1～14 d口服卡培他滨2000 mg/m2，15～21 d间歇）［12-14］，后行根治性手术，术后辅助治疗，期间密切随访患者生存期［13］。

1.5 手术方式及标本采集

均由专业的外科团队行全直肠系膜切除术［15］，在手术标本离体30 min内，取癌灶中心癌组织及距肿瘤10 cm以上的直肠组织各200 mg，用PBS溶液将组织表面的血液及污物冲洗干净，剔除坏死组织，用吸水纸吸干残留PBS液，装入无菌冻存管后放入液氮速冻，转移到-80℃冰箱保存，一份标本用于实时荧光定量PCR实验和Western blot实验；另取一份同样的标本由组织液浸泡固定后行病理取材和蜡块制备。

1.6 实时荧光定量PCR分析ARHGAP8 mRNA在癌组织和直肠组织中的表达

选取68例直肠癌患者的直肠癌组织和直肠组织进行ARHGAP8表达程度检测。使用Trizol 试剂方法提取直肠癌及直肠组织的总RNA。使用Hifair Ⅲ第1链cDNA 预混液（含gDNA 去除）逆转录试剂盒将2 μg RNA逆转录为第1链cDNA，此步骤应全程均在冰上操作。在NCBI数据库（http：//nih.gov）查得引物序列：人类GAPDH上游引物：5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’，下游引物：5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’；人类ARHGAP8上游引物：5’-GTGCTGAGGTTCACAGTGACGT-3’，下游引物：5’-GGTTGTAGAGCCTCTGGATCTC-3’，由北京擎科生物科技有限公司合成。实时荧光定量PCR程序的测定按照实时荧光定量PCR扩增预混合液试剂盒说明书进行。

1.7 Western blot实验分析ARHGAP8在直肠癌组织和直肠组织中的表达

选取16例直肠癌患者的直肠癌和直肠组织，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀测定裂解缓冲液裂解组织和细胞的蛋白质。使用PierceTM BCA试剂盒进行蛋白质定量分析。将10%的SDS-PAGE分离胶和5% SDS-PAGE浓缩胶放入装有1×电泳液的电泳槽中，加入蛋白质，连接电源，待溴酚蓝指示剂到分离胶底部时停止。将10% SDS-PAGE分离胶蛋白质样品转移到PVDF膜上，转印槽调整电压至110 V，转膜60 min。转膜完毕后，用5%脱脂奶粉将PVDF膜在室温下封闭1 h。将PVDF膜放在抗体稀释液中，4 ℃冰箱过夜。然后，将PVDF膜与二抗在室温下孵育90 min。使用全自动化学发光图像分析系统检测ARHGAP8在癌组织与直肠组织中的表达。

1.8 免疫组织化学分析ARHGAP8在直肠癌组织与直肠组织及化疗前后组织中的表达

选取68例术后直肠癌及直肠组织、44例新辅助化疗患者治疗前和手术切除的直肠癌标本，取适量大小放入组织包埋盒，10%中性缓冲福尔马林溶液固定，用石蜡对固定的组织进行包埋，使用切片机将石蜡组织切成4 μm的组织切片，组织切片用二甲苯和乙醇脱蜡，使用柠檬酸钠抗原修复液对组织进行抗原修复。在组织表面滴加内源性过氧化物酶阻断剂，然后用5%封闭用正常山羊血清封闭。切片与ERp57 Rabbit mAb在4 ℃下孵育过夜，随后与过氧化物酶标记山羊抗兔IgG聚合物室温孵育20 min。将配好的DAB显色液滴加到组织上且需覆盖全部组织，反应呈棕黄色时终止染色。用苏木精复染细胞，盐酸酒精分化，以饱和磷酸氢二钠溶液浸泡蓝染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

使用徕卡显微成像系统对组织切片进行图像拍摄。使用Image J-Fiji（美国国立卫生研究院）软件对免疫组织化学图片进行识别分析，得出平均光密度值，然后使用GraphPad Prism 9.0统计软件进行图表显著性分析，用以判断ARHGAP8在癌组织与直肠组织、不同分期、不同疗效癌组织中表达程度。

ARHGAP8表达程度判定由有资质的病理医生对染色后的组织切片在光学显微镜下随机选取5个视野进行观察，该蛋白表达于细胞质中，阳性者细胞质染色为棕黄色或褐色，分别评估染色细胞比例以及细胞的染色程度。评估标准如下：（1）染色。无染色：0分；淡黄染：1分；棕黄色：2分；深黄色：3分。（2）染色细胞比。染色细胞≤5%：0分；5%＜染色细胞≤25%：1分；25%＜染色细胞≤50%：2分；染色细胞＞50%：3分。两项得分相乘，低表达≤3分，高表达＞3分。

1.9 病理学TRG分级

由2名副高以上的病理医生对切片在显微镜下进行TRG分期判读［3］。TRG标准参照美国癌症联合委员会TRG进行评估［16-17］。TRG 0级：完全退缩，镜下无可见的肿瘤细胞；TRG 1级：镜下仅见单个或小灶肿瘤细胞；TRG 2级：退缩明显但明显可见残余肿瘤多于单个或小灶肿瘤细胞；TRG 3级：可见大面积残余肿瘤组织，少量退缩或无退缩［3］。TRG 0～1级为疗效良好，TRG 2～3级为疗效较差；TRG 0～2级为治疗有效，TRG 3级为治疗无效。

1.10 统计学处理

采用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差表示，正态性检验采用Shapiro-Wilk检验，多组独立非正态分布的连续变量选择Kruskai-Wallis H检验，计数资料采用频数与百分率表示，n≥40且理论频数＜5的格子数在50%以下时使用Pearson卡方；n＜40且理论频数小于5的格子数在50%以上时使用Fisher确切概率法分析。Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析检测ARHGAP8在直肠癌组织与直肠组织的表达

基于UALCAN网站比较直肠癌样本中ARHGAP8基因在mRNA表达水平的差异，结果显示ARHGAP8在癌组织及直肠组织中的表达水平差异有统计学意义（P＜0.001）（图1A）；进一步分析ARHGAP8表达在直肠组织及直肠癌组织中的临床数据，结果显示ARHGAP8与肿瘤分期（P=0.024）、淋巴结转移（P=0.007）、年龄（P=0.005）等临床特征密切相关（图1B～1D），而与MSI（P=0.143）、TMB（P=0.175）无相关性（图1E、1F）。

2.2 ARHGAP8 mRNA 在直肠癌组织和直肠组织中的表达

将实时荧光定量PCR检测结果表达量绘制表达分布图，结果显示ARHGAP8在癌组织中的表达显著高于直肠组织（P＜0.001）（图2）。

2.3 ARHGAP8 蛋白在直肠癌组织和直肠组织中的表达

Western blot检测结果显示ARHGAP8在癌组织中的表达显著高于直肠组织（P=0.011）（图3）。免疫组织化学结果显示ARHGAP8蛋白在细胞质中表达，直肠组织直肠腺细胞结构清晰，形态规整，未见异型性，ARHGAP8不表达或轻微表达；癌组织中细胞异型性和组织结构异型性明显，细胞核可见核分裂象。ARHGAP8在直肠组织中不表达或轻微表达（图4A），在高分化癌组织腺泡结构清晰，ARHGAP8表达较直肠组织明显升高（图4B），在中分化癌组织表达程度与高分化相似（图4C），在低分化癌组织细胞异型性、组织异型性明显，ARHGAP8表达程度较中、高分化组织升高（图4D）。将免疫组织化学图片经Image J程序处理，将数据带入GraphPad程序，结果显示ARHGAP8在癌组织中的表达显著高于直肠组织（P＜0.001）。

2.4 ARHGAP8的表达与直肠癌临床及病理特征的关系

68例直肠癌中，Ⅰ期5例（7.4%）、Ⅱ期4例（5.9%）、Ⅲ期32例（47.1%）、Ⅳ期27例（39.7%）。ARHGAP8的表达与肿瘤大小（P=0.010）、病理分期（P=0.005）呈正相关；而与肿瘤分化程度、肝转移、肺转移、腹腔转移、淋巴结转移、Ki-67、MSI均无相关性（P均gt;0.05）（表1）。

2.5 ARHGAP8在癌组织新辅助化疗前后的表达

完成新辅助化疗并接受手术的44例患者中，ARHGAP8蛋白在各TRG分级化疗后高表达率较化疗前均呈下降趋势，且表达下降率随TRG分级的增加逐渐递减（表2）。65.91%（29/44）的患者治疗有效。其中高表达有效率为53.33%（16/30）；低表达有效率为92.86%（13/14），差异有统计学意义（P=0.033）。

新辅助化疗前后的MRI、肠镜、病理HE染色、免疫组织化学可见TRG 0级患者化疗后未见癌组织残留，病理下仅可见纤维细胞及少量炎症细胞，ARHGAP8化疗后少量表达，较化疗前表达明显下降；TRG 1级患者化疗后明显缩小，病理仅可见少量癌簇残留，ARHGAP8化疗后表达下降；TRG 2级患者化疗后少量退缩，化疗后可见明显癌细胞残留，化疗后ARHGAP8表达明显；TRG 3级患者化疗后肿瘤退缩不明显，可见大量癌细胞残留，化疗后ARHGAP8大量表达（图5～12）；检测后将图片经Image J程序处理，结果显示ARHGAP8的表达在新辅助化疗后显著降低（P＜0.001）。

2.6 ARHGAP8的表达与新辅助化疗疗效的关系

44例新辅助化疗患者中，在TRG 0～2级中，ARHGAP8蛋白在化疗后的表达较化疗前显著降低（P均lt;0.001），而在TRG 3级中，ARHGAP8蛋白在化疗前后中的表达差异无统计学意义（P=0.184）；44例新辅助化疗患者中，47.73% （21/44）的患者治疗效果良好（TRG 0～1级），65.91%（29/44）的患者治疗有效（TRG 0～2级），52.27%（23/44）的患者治疗效果不明显（TRG 2～3级），在TRG 0～1级（肿瘤退缩明显）、TRG 0～2级（治疗有效）、TRG 2～3级（肿瘤退缩不明显），ARHGAP8的蛋白表达在化疗前后差异均有统计学意义（P＜0.001，P＜0.001，P=0.031）（图13）。

3 讨论

结直肠癌是现阶段常见的消化道肿瘤，其发生率呈逐年上升趋势。结直肠癌因其较高的复发率及转移率（29%～39%）受到广泛关注［18-19］。中低位直肠癌是指距肛缘5～10 cm以内的直肠癌，据中国结直肠癌手术病例登记数据库统计，中低位直肠癌占直肠癌的92.8％，是直肠癌最常见的发生部位［20］。进展期直肠癌是指T3或T4的原发性肿瘤或存在淋巴结转移（T3～4和/或N+）或Ⅱ期（CT3～4，N0）、Ⅲ期（CT1～4，N1～3）的直肠癌［21］。其因较低的5年生存率、较高的复发转移率受到学界广泛关注，如何有效提高中低位进展期直肠癌手术切除率、改善患者生存质量，成为学界广泛关注的话题。

新辅助化疗即术前新辅助化疗+全直肠系膜切除术+术后辅助化疗的“夹心饼”模式，是现阶段中低位进展期直肠癌常见的治疗手段，该模式可通过促使肿瘤回缩、降期，以提高肿瘤的切除率，降低局部复发率［4］。但现阶段仍缺少可以准确预测新辅助化疗疗效敏感性的指标［22-25］，这也是直肠癌新辅助化疗的研究热点。

ARHGAP8是近年发现的RHOGAP家族的新成员，在乳腺癌与结直肠癌中的表达显著高于直肠组织，其相对分子质量为53 500，位于染色体22q13.31上杂合性缺失的关键区域内，拥有保守的结构域GAP［26-27］。其中的同源区段存在保守的精氨酸指状结构，可插入RhoGTPase活性位点，最终使其易与GDP结合而成失活状态［28］，其C端具有SH3结构，能与富含脯氨酸结构的蛋白相互作用［29-31］，其相应的蛋白质通过5VCpG岛的高甲基化在肿瘤中表观遗传失活，随后转录［32］。通过对结合了GTP的三聚体G蛋白及RHO家族蛋白发挥加速解离的作用，从而发挥抑制GTP结合的功能［33］。因此，其可以改变细胞信号转导的作用。ARHGAP8的活性受磷脂化、磷酸化、蛋白质相互作用、蛋白质水解等多机制调控，深度参与基因转录、细胞分裂分化、胞吞胞吐、细胞凋亡、细胞癌变以及肿瘤细胞增殖、浸润、侵袭、转移的过程［32-34］。

本研究应用生物信息学分析筛选出直肠癌与直肠组织中表达存在差异的基因ARHGAP8，结果显示ARHGAP8与肿瘤分期、淋巴结转移、年龄等临床特征密切相关，与MSI、TMB无相关性，但随着ARHGAP8表达含量的上升，MSI、TMB也呈上升趋势，提示ARHGAP8在调节肿瘤微环境的免疫浸润中发挥作用。采用实时荧光定量PCR、Western blot、免疫组织化学技术对癌组织和直肠组织中ARHGAP8的表达强度进行检测，结果显示ARHGAP8在癌组织中的表达显著高于直肠组织，ARHGAP8的表达水平在新辅助化疗后显著低于化疗前。免疫组织化学检测显示在TRG 0～2级中，ARHGAP8的表达在新辅助化疗后显著降低，而在TRG 3级中，新辅助化疗前后ARHGAP8的表达差异无统计学意义，提示ARHGAP8表达的变化与XELOX方案新辅助化疗疗效趋势一致，疗效好及疗效差患者治疗后ARHGAP8表达均降低，提示TRG分级0～2级的化疗后表达明显降低，TRG分级3级的化疗后表达无差异；治疗有效患者治疗后ARHGAP8表达均降低，无效患者治疗前后无差异，且ARHGAP8低表达的直肠癌患者对XELOX方案新辅助化疗更为敏感，ARHGAP8低表达的中低位局部进展期直肠癌患者对XELOX方案新辅助化疗更为敏感。

综上，本研究通过生物信息学分析及临床验证，为直肠癌发生进展挖掘新的生物学指标，同时为中低位进展期直肠癌XELOX方案新辅助化疗提供可靠的预测指标，从而精准指导临床治疗。但本研究仅限于临床水平，缺少后续一系列的细胞学实验及动物实验佐证，且样本数量相对较少，需要多中心、大样本的支持，这也是今后的研究方向。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 郗宇宁：参与实验与论文撰写；薛军：论文设计指导，总体规划；武雪亮：论文设计指导及修改；屈明：提供部分数据，提出实验思路；孙光源：进行部分设计，通体修改；韩磊：提供部分数据，进行统计学分析；郭飞：进行部分统计学分析；张春泽：提出部分修改意见，指导修改；王一飞：参与部分数据收集整合；梁卫政：指导实验操作

参 考 文 献

［1］Deng Y.Rectal cancer in Asian vs.Western countries：why the variation in incidence［J］.Curr Treat Options Oncol，2017，18（10）：64.DOI：10.1007/s11864-017-0500-2.

［2］中国结直肠癌诊疗规范（2023版）［J］.消化肿瘤杂志（电子版），2023，15（3）：177-206.DOI：10.19538/j.cjps.issn1005-2208.2023.06.02.

［3］Keller DS，Berho M，Perez RO，et al.The multidisciplinary management of rectal cancer［J］.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2020，17（7）：414-429.DOI：10.1038/s41575-020-0275-y.

［4］Liu D，Langer R，Liu D，et al.Grading of tumor regression of gastrointestinal carcinomas after neoadjuvant therapy［J］.Pathologe，2022，43（1）：51-56.DOI：10.1007/s00292-021-01041-5.

［5］Zhang J，Liang C，Niu W.Survivorship after neoadjuvant chemotherapy［J］.Lancet Oncol，2022，23（3）：e95.DOI：10. 1016/S1470-2045（22）00011-0.

［6］孙志刚，向仁伸，张琦，等.直肠癌新辅助放化疗后根治性手术患者的复发情况［J］.中华医学杂志，2023，103（24）：1836-1841.DOI：10.3760/cma.j.cn112137-20230407-00560.

［7］Canter RJ.Chemotherapy：does neoadjuvant or adjuvant therapy improve outcomes［J］.Surg Oncol Clin N Am，2016，25（4）：861-872.DOI：10.1016/j.soc.2016.05.013.

［8］牛亚进.血清触珠蛋白、蛋白质二硫键异构酶A3在结直肠癌筛查、诊断和分期中的临床意义［D］.张家口：河北北方学院，2022.DOI：10.27767/d.cnki.ghbbf.2022.000048.

［9］Johnstone CN，Castellví-Bel S，Chang LM，et al.ARHGAP8 is a novel member of the RHOGAP family related to ARHGAP1/CDC42GAP/p50RHOGAP：mutation and expression analyses in colorectal and breast cancers［J］.Gene，2004，336（1）：59-71.DOI：10.1016/j.gene.2004.01.025.

［10］Baidoun F，Elshiwy K，Elkeraie Y，et al.Colorectal cancer epidemiology：recent trends and impact on outcomes［J］.Curr Drug Targets，2021，22（9）：998-1009.DOI：10.2174/1389450121999201117115717.

［11］Kodama H，Terazawa T，Ishizuka Y，et al.Retrospective comparison of mFOLFOXIRI with XELOX/SOX as neoadjuvant chemotherapy for locally advanced rectal cancer［J］.In Vivo，2021，35（2）：977-985.DOI：10.21873/invivo.12340

［12］Ueki T，Manabe T，Inoue S，et al.A feasibility study of neoadjuvant XELOX without radiotherapy for locally advanced lower rectal cancer［J］.Anticancer Res，2016，36（2）：741-747.

［13］Papamichael D，Glynne-Jones R.Identifying patients who may benefit from oxaliplatin-containing perioperative chemo（radio）therapy for rectal cancer［J］.Ann Oncol，2018，29（8）：1616-1618.DOI：10.1093/annonc/mdy230.

［14］André T，Iveson T，Labianca R，et al.The IDEA （international duration evaluation of adjuvant chemotherapy） collaboration：prospective combined analysis of phase Ⅲ trials investigating duration of adjuvant therapy with the FOLFOX （FOLFOX4 or modified FOLFOX6） or XELOX （3 versus 6 months） regimen for patients with stage Ⅲ colon cancer：trial design and current status［J］.Curr Colorectal Cancer Rep，2013，9（3）：261-269.DOI：10.1007/s11888-013-0181-6.

［15］Zolfaghari S，Williams LJ，Moloo H，et al.Rectal cancer：current surgical management［J］.Minerva Chir，2010，65（2）：197-211.

［16］Chan TA，Yarchoan M，Jaffee E，et al.Development of tumor mutation burden as an immunotherapy biomarker：utility for the oncology clinic［J］.Ann Oncol，2019，30（1）：44-56. DOI：10.1093/annonc/mdy495.

［17］Wei J，Huang R，Guo S，et al.ypTNM category combined with AJCC tumor regression grade for screening patients with the worst prognosis after neoadjuvant chemoradiation therapy for locally advanced rectal cancer［J］.Cancer Manag Res，2018，10（3）：5219-5225.DOI：10.2147/CMAR.S179151.

［18］Dekker E，Tanis PJ，Vleugels JLA，et al.Colorectal cancer［J］.Lancet，2019，394（10207）：1467-1480.DOI：10.1016/S0140-6736（19）32319-0.

［19］Kasi A，Abbasi S，Handa S，et al.Total neoadjuvant therapy vs. standard therapy in locally advanced rectal cancer：a systematic review and meta-analysis［J］.JAMA Netw Open，2020，3（12）：e2030097.DOI：10.1001/jamanetworkopen.2020.30097.

［20］姚宏伟，李心翔，崔龙，等.中国结直肠癌手术病例登记数据库2019年度报告：一项全国性登记研究［J］.中国实用外科杂志，2020，40（1）：106-110，116.DOI：10.19538/j.cjps.issn1005-2208.2020.01.19.

［21］Oronsky B，Reid T，Larson C，et al.Locally advanced rectal cancer：the past，present，and future［J］.Semin Oncol，2020，47（1）：85-92.DOI：10.1053/j.seminoncol.2020.02.001.

［22］Lech G，Sotwiński R，Sodkowski M，et al.Colorectal cancer tumour markers and biomarkers：recent therapeutic advances［J］.World J Gastroenterol，2016，22（5）：1745-1755. DOI：10.3748/wjg.v22.i5.1745.

［23］Müller D，Gyo″rffy B.DNA methylation-based diagnostic，prognostic，and predictive biomarkers in colorectal cancer［J］.Biochim Biophys Acta Rev Cancer，2022，1877（3）：188722. DOI：10.1016/j.bbcan.2022.188722.

［24］Li Y，Wang J，Ma X，et al.A review of neoadjuvant chemoradiotherapy for locally advanced rectal cancer［J］.Int J Biol Sci，2016，12（8）：1022-1031.DOI：10.7150/ijbs.15438.

［25］Li C，Guan Z，Zhao Y，et al.Predictors of pathologic complete response in patients with residual flat mucosal lesions after neoadjuvant chemoradiotherapy for locally advanced rectal cancer［J］.Chin J Cancer Res，2022，34（4）：383-394.DOI：10.21147/j.issn.1000-9604.2022.04.06

［26］Castellví-Bel S，Castells A，Johnstone CN，et al.Evaluation of PARVG located on 22q13 as a candidate tumor suppressor gene for colorectal and breast cancer［J］.Cancer Genet Cytogenet，2003，144（1）：80-82.DOI：10.1016/s0165-4608（03）00034-7.

［27］Wong DCP，Pan CQ，Er SY，et al.The scaffold RhoGAP protein ARHGAP8/BPGAP1 synchronizes Rac and Rho signaling to facilitate cell migration［J］.Mol Biol Cell，2023，34（3）：ar13.DOI：10.1091/mbc.E21-03-0099.

［28］Li X，Tao Y，Wang X，et al.Advanced glycosylation end products （AGEs） controls proliferation，invasion and permeability through orchestrating ARHGAP18/RhoA pathway in human umbilical vein endothelial cells［J］.Glycoconj，2020，37（2）：209-219.DOI：10.1007/s10719-020-09908-0.

［29］Bourguignon LY.Hyaluronan-CD44 interaction promotes microRNA signaling and RhoGTPase activation leading to tumor progression［J］.Small GTPases，2012，3（1）：53-59.DOI：10.4161/sgtp.19110.

［30］Liu L，Xie D，Xie H，et al.ARHGAP10 inhibits the proliferation and metastasis of CRC cells via blocking the activity of RhoA/AKT signaling pathway［J］.Onco Targets Ther，2019，12（2）：11507-11516.DOI：10.2147/OTT.S222564.

［31］Shan Z，Haaf T，Popescu NC.Identification and characterization of a gene encoding a putative mouse Rho GTPase activating protein gene 8，Arhgap8［J］.Gene，2003，303（2）：55-61.DOI：10.1016/s0378-1119（02）01143-5.

［32］Feng Z，Liu Z，Peng K，et al.A prognostic model based on nine DNA methylation-driven genes predicts overall survival for colorectal ancer［J］.Front Genet，2022，12：779383.DOI：10.3389/fgene.2021.779383.

［33］Johan MZ，Samuel MS.Rho-ROCK signaling regulates tumor-microenvironment interactions［J］.Biochem Soc Trans，2019，47（1）：101-108.DOI：10.1042/BST20180334.

［34］Syrovatkina V，Alegre KO，Dey R，et al.Regulation，signaling，and physiological functions of G-proteins［J］.Mol Biol，2016，428（19）：3850-3868.DOI：10.1016/j.jmb.2016.08.002.

（收稿日期：2023-10-24）