阿霉素白蛋白透明质酸纳米粒的制备及评价

陶静 李黎 廖蓉惠 涂娜 沈雪

摘要：目的 制備以人血清白蛋白（human serum albumin， HSA）和透明质酸（hyaluronic acid， HA）为载体，负载抗肿瘤药物阿霉素（doxorubicin， DOX）的纳米粒子，对纳米粒制备处方进行优化，并对制剂进行质量评价，初步考察纳米粒的体外抗肿瘤效果。方法 采用去溶剂-交联法制备得到负载阿霉素的白蛋白透明质酸纳米粒子（DOX-HSA-HA NPs），并利用Box-Behnken Design响应面优化筛选最优处方，采用透射电镜、激光粒度仪对纳米粒的形貌和粒径进行考察，并考察纳米粒的体外释放效果及体外溶血情况，最后通过细胞毒性实验初步考察纳米粒的体外抗肿瘤效果。结果 按优化条件制得的DOX-HSA-HA NPs透射电镜下呈球形，分布均一，粒径为（213.39±0.79） nm， PDI值为0.062±0.012，Zeta电位为-25.53 mV，包封率达88.85%，载药量达2.06%；体外释放结果表明，在pH 6.8和pH 7.4条件下DOX-HSA-HA NPs具有缓释效果，加入透明质酸酶之后，DOX的释放量增加；溶血性实验表明，纳米载体材料HSA-HA NPs无溶血风险，可用于静脉注射给药；体外细胞实验表明，空白载体对细胞基本无毒性，相比于DOX-HSA NPs， DOX-HSA-HA NPs对小鼠乳腺癌4T1细胞的细胞毒性增强。结论 采用去溶剂-交联法制得的DOX-HSA-HA NPs分布均匀，包封率高，具有明显的缓释作用和增强的细胞毒性。

关键词：人血清白蛋白；透明质酸；阿霉素；纳米粒；体外抗肿瘤

中图分类号：R978.1  文献标志码：A

Preparation and evaluation of albumin and hyaluronic acid nanoparticles loaded with doxorubicin

Tao Jing， Li Li， Liao Ronghui， Tu Na， and Shen Xue

（Antibiotics Research and Re-evaluation Key Laboratory of Sichuan Province， Sichuan Industrial Institute of Antibiotics， School of Pharmacy， Chengdu University， Chengdu 610106）

Abstract    Objective In order to improve the efficiency of cancer treatment， doxorubicin（DOX）-loaded Human Serum Albumin（HSA） and Hyaluronic acid（HA） nanoparticles（abbreviated as DOX-HSA-HA NPs） were prepared and optimized. Then， the drug properties and antitumor activity were evaluated. Methods The DOX-HSA-HA NPs was prepared by the solvent removal and crosslinking method. Then， the Box-Behnken design response surface methodology was used to optimize the initial prescription. In addition， the morphology of the nanoparticles was investigated by transmission electron microscope（TEM）， and the size distribution of the nanoparticles was determined by ZetaPlus particle size and zeta potential analyzer. Moreover， the release behavior of the nanoparticles in vitro was investigated by dialysis， and the hemolysis in vitro was investigated using healthy rats. Finally， the anti-tumor effect of the nanoparticles in vitro was preliminarily investigated by cytotoxicity assays. Results The DOX-HSA-HA NPs prepared under the optimized conditions were spherical and uniformly distributed， with a particle size of （213.39 ± 0.79） nm， a PDI of 0.062 ± 0.012， and a Zeta potential of -25.53 mV. The encapsulation rate and drug loading capacity of DOX were 88.85% and 2.06%. In vitro release results showed that DOX-HSA-HA NPs had a sustained release effect at pH 6.8 and pH 7.4， and the DOX release rate increased when treated with hyaluronidase. The hemolytic test showed that the nanocarrier materials HSA-HA NPs were safe and non-toxic， and were suitable for intravenous administration. Cytotoxicity assay showed that HSA-HA NPs were nontoxic to 4T1 cells（mouse breast cancer cells）， and DOX-HSA-HA NPs were more cytotoxic to 4T1 cells than DOX-HSA NPs.  Conclusion The DOX-HSA-HA NPs prepared by the solvent removal and crosslinking method exhibited uniform particle size and size distribution， high encapsulation efficiency， a sustained drug release behavior， and showed enhanced cytotoxicity.

Key words  Human serum albumin（HSA）; Hyaluronic acid（HA）; Doxorubicin（DOX）; Nanoparticles（NPs）; Anti-tumor in vitro

阿霉素（doxorubicin， DOX）是一种抗肿瘤类抗生素，抗瘤谱广，可用于乳腺癌、肝癌、膀胱癌等多种癌症的治疗[1]。然而，由于DOX对肿瘤细胞缺乏靶向性，其进入血液循环后非特异性分布的特点造成了许多不良反应，如心脏毒性、骨髓抑制、粘膜炎和脱发等限制了阿霉素的临床应用[2-3]。

纳米载药系统是一种新型的载药体系，是一种具有特定功能的新物质[4]，在包载化疗药物、多肽和蛋白药物、基因药物等方面具有很大的潜力。采用纳米粒包载药物，能提高药物靶向性，减少毒副作用[5-6]。

白蛋白（albumin）是一种天然蛋白，来源广泛，种类繁多，其中人血清白蛋白（human serum albumin， HSA）是一种广泛应用的载体[7]，研究发现，将药物包载于HSA纳米粒中，能降低巨噬细胞对纳米粒的亲和力，避免药物被清除，延长药物体内循环[8]。HSA相对分子质量约为665000，HSA三级结构存在两个药物高亲和力结合位点，位点I和II分别位于白蛋白的疏水空腔，药物在该位点的结合主要通过疏水相互作用、静电相互作用和氢键作用实现[9-10]。因此，HSA作为一种天然载体可与多种药物结合，实现药物的高效负载。研究证实，多种肿瘤细胞过表达分泌蛋白SPARC，白蛋白首先通过肿瘤血管内皮细胞表达的gp60受体（一种分子量为60 kDa的糖蛋白）介导的内吞作用进入肿瘤间质，随后与肿瘤细胞过表达的分泌蛋白SPARC结合，促使包载药物的白蛋白纳米粒富集在肿瘤细胞中，提高药物对肿瘤组织的靶向性[11-12]。因此可以利用细胞膜上白蛋白受体跨膜转运机制，将药物靶向运输到肿瘤组织部位。

为了进一步提高纳米制剂的靶向肿瘤能力和肿瘤内部穿透能力，可将白蛋白与一些具有靶向能力以及能被特异性酶触发降解的物质结合来制备纳米制剂。透明质酸（hyaluronic acid， HA）作为一种内源性大分子，具有相容性好、无免疫原性、生物可降解性等优点。HA可被肿瘤区域丰富的透明质酸酶（hyaluronidase， HAase） 降解，特别是在高转移性肿瘤内[13-14]。因此，利用透明质酸构建纳米颗粒，能够获得肿瘤特异性透明质酸酶敏感的纳米粒，当纳米粒到达肿瘤部位，被透明质酸酶降解，使部分药物释放，同时大粒径的纳米粒结构改变，转变为小粒径的纳米粒，进一步深入渗透到肿瘤内部，使药物达到肿瘤深部穿透的效果。由于HA具有亲水性，因此在纳米粒子表面可以形成一亲水性层，从而保护纳米粒免受调理素的破坏，延长纳米粒的血液循环时间[15]。细胞表面受体CD44在肿瘤增殖和转移过程具有调节作用，其在多种肿瘤细胞上高表达，研究证明，HA可与CD44受体特异性结合，使基于透明质酸的纳米粒具有对肿瘤细胞主动靶向的能力[16-17]。因此，将透明质酸制备成纳米粒，可赋予纳米载体具有CD44介导的主动靶向能力、透明质酸酶触发的药物释放增多、药物进一步渗透到肿瘤深处部位等优点，达到延长药物作用时间、提高治疗效果的目的。

因此，本实验将HSA和HA联合构建纳米载体并负载抗肿瘤药物DOX，得到负载阿霉素的白蛋白透明质酸纳米粒子（DOX-HSA-HA NPs），以期增加DOX的靶向性，减少毒副作用，并增强抗肿瘤效果。

1 仪器及试药

1.1 药品与试剂

阿霉素（批号MB1087-1，纯度＞98%）、透明质酸（批号MB3113-1，含量＞95%） 购自大连美仑生物技术；人血清白蛋白（批号S20113010、浓度为25%） 购自成都蓉生药业；戊二醛（纯度25%）、透明质酸酶购自上海泰坦科技；氢氧化钠购自成都科龙化工试剂；丙酮购自成都市科隆化学品；细胞培养基、胰酶购自Gibco公司；CCK-8试剂盒、MTT试剂盒购自上海碧云天生物技术。

1.2 仪器

CPA225D型十万分之一电子天平（德国 Sartorius公司）；DF-101S型磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司）；UV-2450紫外分光光度计（Kyoto Japan）；ZEN3600纳米激光粒度仪（英国Malvern公司）；TGL-22S型高速冷冻离心机（四川蜀科仪器有限公司）；HT7700低压透射电镜（日本Hitachi公司）；THZ-92A恒温振荡器（上海博讯实业有限公司）；BPN-150CN（UV）二氧化碳培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；ELx800酶标仪（BioTek公司）；SW-CJ-2D超净工作台（济南森亚实验仪器有限公司）；Axioscope 5荧光显微镜（上海卡尔蔡司）。

1.3 细胞

小鼠乳腺癌细胞4T1细胞：来源于四川抗菌素工业研究所。

2 方法与结果

2.1 DOX-HSA-HA NPs的制備

本试验采用去溶剂化-交联法[18]制备DOX-HSA-HA NPs。精密量取20%的HSA（10 mg/50 mL） 适量，取超纯水稀释，得到浓度为2%的HSA溶液，用0.1 mol/L氢氧化钠调节pH到8，另精密称取6 mg的DOX和25 mg的HA，溶于10 mL的HSA溶液中，充分搅拌0.5 h，使药物充分溶解混合，快速搅拌状态下以1 mL/min的速度滴加丙酮，至HSA溶液出现浑浊，停止滴加丙酮，继续搅拌0.5 h，加入5%的戊二醛250 μL交联2 h，最后真空旋转蒸发除去有机溶剂，离心纯化除去多余的戊二醛等，得到DOX-HSA-HA NPs。

2.2 DOX分析方法的建立

2.2.1 紫外检测方法

精密称取一定量的DOX样品，超纯水溶解后定容，得到1 mg/mL的DOX储备液，4 ℃避光保存。储备液用超纯水稀释，得到一定浓度的DOX溶液，紫外全波长扫描，记录其吸收图谱，在480 nm处出现吸收峰，作为DOX的测定波长。

2.2.2 DOX标准曲线的绘制

精密量取DOX储备液，用超纯水稀释，分别得到浓度为10、20、30、40、50和60 μg/mL的一系列溶液，于波长480 nm处测定其吸光值A，以吸光值A和浓度C作图，进行线性回归分析，得到回归方程为Y=0.0156X+0.0139（R2=0.9992、n=6），结果表明DOX在浓度10～60 μg/mL范围之间线性关系良好。

2.2.3 专属性试验

分别取对照储备液（1 mg/mL DOX）、供试品溶液（DOX-HSA-HA NPs）、空白纳米溶液（HSA-HA NPs），稀释到一定浓度，进行全波长扫描，记录其特征吸收峰。结果见图1，HSA和HA对DOX的测定无干扰，表明在波长480 nm下测定DOX专属性良好。

2.2.4 精密度试验

取10 mL容量瓶，加入一定量的DOX储备液，超纯水稀释定容，得到浓度为30 μg/mL的DOX溶液，于波长480 nm处连续测定吸收值，重复6次，计算RSD值，结果为0.95%，表明精密度良好。

2.2.5 重复性试验

精密吸取一定量的DOX-HSA-HA NPs于10 mL容量瓶中，加甲醇超声破乳，定容，得到浓度约为30 μg/mL的DOX溶液，过0.22 μm微孔滤膜，续滤液在紫外480 nm下测定吸收值，重复6次，计算RSD值，结果为0.37%，表明该方法重复性良好。

2.2.6 DOX-HSA-HA NPs包封率和载药量的测定

采用低温高速离心法测定包封率和载药量。精密吸取1 mL的DOX-HSA-HA NPs，在转速15000 r/min、温度4 ℃条件下离心15 min，取上清液过0.22 μm滤膜，续滤液于紫外480 nm下测定吸收值，计算游离药物的量。采用超声破乳法测定样品中总药物量，吸取1 mL的DOX-HSA-HA NPs，加入适量甲醇，420 W的功率下超声30 min，紫外480 nm下测定吸收值，计算DOX-HSA-HA NPs中DOX药物的总量，包封率及载药量计算公式如下：

包封率=（W总药-W游离）/W总药×100%                                   （1）

载药量=（W总药-W游离）/（W总药-W游离+W载体）×100%             （2）

其中W游離为游离药物的质量，W总药为总药物质量，W载体为空白载体的质量

通过最优处方条件下制得纳米粒样品，根据低温高速离心法测得包封率为88.85%，载药量为2.06%。

2.2.7 冷冻高速离心回收率实验

取9个10 mL容量瓶，分别加入适量空白纳米载体，再分别吸取0.24、0.30和0.36 mL的DOX储备液，超纯水定容，分别得到低、中、高（80%、100%、120%）3种浓度的DOX溶液，每个浓度平行3组。4 ℃、15000 r/min条件下离心15 min，取上层清液，紫外480 nm下测定吸收值，计算回收率及RSD值，结果表明，3种浓度的DOX的回收率均在98%～102%之间，并且RSD值均小于2%，表明冷冻高速离心方法的回收率良好，该方法可用于包封率和载药量的测定。

2.3 纳米粒处方的优化

2.3.1 BOX-Behnken Design 优化处方

通过前期单因素实验，优化纳米粒的处方工艺，选择HA浓度（A）、HSA浓度（B）、HSA的pH值（C）3个因素，设计3个水平，以包封率作为响应值，使用Box-Behnken Design对纳米粒制备处方进行响应面优化分析，筛选最优处方，设计因素水平见表1。通过表1进行试验设计，结果见表2。

2.3.2 响应面优化分析

利用Design-expert软件对表2数据进行拟合，得到最优拟合方程，该方程式为：包封率=85.68+2.21A-0.66B+9.35C+1.36AB+3.53AC-0.76BC-12.95A2-17.00B2-19.67C2，模型：P＜0.05，具有显著性差异（P＜0.05），失拟项：P=0.0589，无显著性差异（P＞0.05），表明该方程拟合充分，该模型可用于筛选确定DOX-HSA-HA NPs的最优处方制备条件[19]。

通过Design-expert软件得到3个影响因素之间的交互3D作用曲面图，分析不同影响因素对纳米粒包封率的影响，结果如图2所示，随着HSA的浓度、pH值和HA浓度的增加，包封率呈现先增加后减少的趋势，对各因素进行预测，得到最优处方值为HA浓度2.56 mg/mL、HSA浓度1.99%、HSA的pH值为8.26，预测包封率为86.97%。

2.3.3 处方验证

根据“2.3.2”下得到的响应面优化最佳处方条件，平行制备3批DOX-HSA-HA NPs样品，通过高速离心法测定包封率，其平均包封率为88.85%，与软件预测值相近，证明模型拟合成功，可用于DOX-HSA-HA NPs的处方优化分析，结果可靠。

2.4 纳米粒质量评价

2.4.1 表面形态观察

采用透射电子显微镜（TEM） 观察DOX-HSA-HA NPs的形貌及分布。采用磷钨酸负染法制备样品，取适量DOX-HSA-HA NPs溶液，滴加至铜网上，放置15 min，再次滴加适量磷钨酸钠负染液，放置5 min，TEM下观察纳米粒子的形貌，结果见图3。结果表明，DOX-HSA-HA NPs外观光滑且均匀分布，呈球形粒子，粒径与激光粒度仪测得值相近。

2.4.2 粒径及电位

取优化处方后的DOX-HSA-HA NPs，超纯水稀释，于激光粒度仪下测量粒径、Zeta电位、PDI，记录数据，结果见图4～5，DOX-HSA-HA NPs的粒径为（213.39±0.79） nm，PDI为0.062±0.012，Zeta电位为-23.53 mV。

2.4.3 体外释放

采用透析法考察不同pH条件下DOX-HSA-HA NPs的释放行为。分别选用pH 7.4和pH 6.8的磷酸盐缓冲液作为释放介质，分别模拟正常组织以及肿瘤弱酸性微环境条件[20]。分别吸取DOX储备液和DOX-HSA-HA NPs溶液2 mL于3000 K透析袋中，将两端扎紧，避免溶液渗漏，置于40 mL的pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，平行3组，100 r/min、37 ℃条件下震荡，于不同时间点取样，并补充同体积的介质。在波长480 nm处测定取样介质中DOX浓度，计算释放药物量。同上考察游离DOX和纳米粒在pH 6.8介质中的释放。为了考察透明质酸酶对纳米粒中透明质酸的降解作用，在pH 6.8条件下，将透明质酸酶（150 U/mL）与纳米粒子共同孵育，考察其体外释放能力，以累积释放率（Q/%） 为纵坐标，取样时间点（t/h） 为横坐标，分别绘制游离DOX和纳米粒中DOX的释放曲线，见图6，在2种释放介质中，游离DOX在8 h后可基本释放完全，DOX-HSA-HA NPs无明显突释现象，72 h后释放率可达到50%，具有明显的缓释效果，在HAase的作用下，DOX释放增加，可能是由于纳米粒中的HA被HAase降解成低聚糖，并进一步降解为单糖及其衍生物，导致纳米粒结构部分崩解，使得DOX的累积释放增加，72 h后释放可达到80%[21]。

2.4.4 体外溶血性实验

为考察纳米粒的静脉注射安全及可行性，对纳米粒进行体外溶血性试验考察。取健康 SD大鼠血0.5 mL，加入生理盐水稀释，置于离心管中，1500 r/min条件下离心3 min，多次清洗，得到红细胞沉淀，加入生理盐水混匀，4 ℃冰箱放置备用。

将不同浓度的DOX-HSA-HA NPs按照一定的体积比和红细胞在37 ℃条件下孵育2 h，同时设置生理盐水作阴性对照组（无裂解组），超纯水作阳性对照组（100%裂解组），取出，3000 r/min条件下，离心4 min，540 nm处测定上清液的吸光值A，计算溶血率：

溶血率%=（A样-A阴） /（A阳-A阴） ×100%                              （3）

A样 表示DOX-HSA-HA NPs样品的吸光度值、A阳表示超纯水组的吸光度值、A阴表示生理盐水组的吸光度值。

体外溶血性实验结果如图7所示，离心之后，阳性对照组的红细胞完全破裂，出现全溶血现象，阴性对照组和各样品组红细胞完整并沉积在底部，未出现溶血现象和凝集现象。已有文献报道，当溶血率≤5%时，表明无溶血作用，可以用于静脉注射[22]，根据公式计算，DOX-HSA-HA NPs在各浓度下的溶血率均小于5%，与肉眼观察结果一致，表明DOX-HSA-HA NPs无明显溶血，可适用于静脉注射给药。

2.5 体外抗瘤效果实验

已有文献报道小鼠乳腺癌4T1细胞高表达CD44受体[23-24]，因此选取4T1细胞进行体外毒性试验。细胞经胰酶消化后离心，加入细胞培养基稀释混匀，再以8000个/孔的密度接种于96孔板上，于CO2培养箱中孵育24 h。

取离心纯化后的HSA-HA NPs，DOX-HSA-HA NPs，DOX-HSA NPs分散于一定量的生理盐水中，另精密称取一定量的DOX原料药，生理盐水溶解。

用细胞培养液将上述样品稀释至不同浓度，每个浓度平行3次，每孔200 μL，加入到96孔板中，同时设置空白组（只加培养液）、对照组（只加细胞）、样品组包括游离DOX组、DOX-HSA NPs组、DOX-HSA-HA NPs组、DOX-HSA-HA NPs+HA组（预先将2 mg/mL的HA与4T1细胞孵育2 h，竞争结合CD44受体）。加入样品后继续孵育24 h，再棄去旧培养基，并用PBS清洗一次，加入CCK-8稀释液，在450 nm下测定样品A值，计算细胞存活率，其体外抗肿瘤活性结果如图8所示。

细胞存活率% =（A样品-A空白） /（A对照-A空白）×100%（4）

如图8A所示，浓度为0～400 μg/mL的空白纳米载体HSA-HA NPs与4T1细胞作用24 h后，细胞存活率均高于90%，表明HSA-HA NPs生物相容性良好，可以作为一种安全的载体用于递送药物。

如图8B所示，在1～20 μg/mL的DOX浓度范围内，随着DOX浓度的增加，游离DOX和负载DOX的纳米粒子与4T1细胞孵育24 h后，细胞的存活率逐渐降低，表明游离DOX和负载DOX的纳米粒子的抗肿瘤活性逐渐增强，且具有DOX浓度依赖性，当DOX浓度为20 μg/mL时，DOX-HSA-HA NPs的细胞存活率为32.34%，而预先加HA竞争CD44受体后DOX-HSA-HA NPs组的细胞存活率为42.35%，没有HA靶向载体的DOX-HSA NPs组的细胞存活率为40.97%，游离DOX组的细胞存活率为36.35%；关于预先加HA竞争CD44受体后处理组（DOX-HSA-HA NPs+HA），在各个治疗浓度，其抗肿瘤效果与DOX-HSA NPs治疗组无明显差异，原因是加HA竞争结合CD44受体后，DOX-HSA-HA NPs的主动靶向能力减弱，而DOX-HSA NPs中无HA载体，也就没有增强的主动靶向能力，因此，这两组的治疗效果没有明显的差异；一般地，在同一浓度下，游离DOX的抗肿瘤活性相较于纳米处理组（DOX-HSA NPs组、DOX-HSA-HA NPs组、DOX-HSA-HA NPs+HA组）更强，可能是由于纳米粒呈现出缓释的效果，在经过内吞作用进入肿瘤细胞后，药物缓慢持续释放，经过一定的释放时间后才会到达最高浓度，而游离药物进入细胞后无缓释现象，则是直接到达最高浓度，从而使得游离药物抗肿瘤活性更高[25-26]；此外，预先加入HA竞争结合CD44受体处理组（DOX-HSA-HA NPs+ HA）的细胞存活率高于DOX-HSA-HA NPs处理组，并且，与DOX-HSA NPs相比，DOX-HSA-HA NPs处理的细胞存活率更低，表明DOX-HSA-HA NPs的抗肿瘤活性更强，这些结果证明HA的加入可以增强纳米粒子的主动靶向能力，使载药纳米粒子更多地聚集到肿瘤部位，减少毒副作用，达到更好的治疗效果。

2.6 细胞内吞考察

由于HA能与肿瘤细胞受体CD44特异性结合，因此进一步增加了纳米粒的主动靶向性。为了考察并验证加入HA后的主动靶向性，选用4T1细胞进行细胞内吞试验，并且由于阿霉素具有自发荧光，因此通过细胞内吞荧光图来进一步考察DOX-HSA-HA NPs的主动靶向肿瘤性。细胞经胰酶消化后离心，加入细胞培养基稀释混匀，再以8000个/孔的密度接种于96孔板上，于CO2培养箱中孵育24 h。

取离心纯化后的DOX-HSA-HA NPs，DOX-HSA NPs分散于一定量的生理盐水中，另精密称取一定量的DOX原料药，生理盐水溶解。

用细胞培养液将上述样品稀释至DOX浓度为   5 μg/mL，平行3组，每孔200 μL，加入到96孔板中，样品组包括游离DOX组、DOX-HSA NPs组、DOX-HSA-HA NPs组、DOX-HSA-HA NPs+HA组（预先将2 mg/mL的HA与4T1细胞孵育2 h，竞争结合CD44受体）。细胞孵育12 h后弃去旧培养基，PBS清洗后用DAPI复染核15 min，PBS清洗，在荧光显微镜下拍摄并记录内吞情况，结果如图9所示。结果表明，在相同DOX浓度下，与不加HA载体材料的DOX-HSA NPs组相比，在纳米粒中加入HA载体材料后，DOX-HSA-HA NPs在肿瘤细胞的内吞摄取进一步增加，细胞内荧光强度明显增强，并且，在预先加HA竞争性结合肿瘤细胞上CD44受体组，其荧光强度相较于DOX-HSA-HA NPs组降低，证明了HA在增强纳米粒主动靶向性方面的能力。此外，在游离DOX组，荧光分布与细胞核荧光重合，是因为DOX内吞进入细胞后，掺入到细胞核中DNA碱基对中，因此其荧光分布与细胞核重合，而DOX-HSA-HA NPs由于药物具有缓释效果，因此，在相同时间内，纳米粒中的DOX比游离DOX进入细胞核的速度更慢，而在细胞质中也有部分存在，因此，从荧光显微图中观察到纳米粒的荧光同时存在细胞质和细胞核中。这些结果证明了随着HA的加入，赋予了纳米粒主动靶向肿瘤的能力，有望进一步增加治疗效果。

3 结论

本文以DOX为模型药物，以HSA和HA为载体，通过去溶剂-交联法成功制备得到HSA和HA负载DOX的DOX-HSA-HA NPs。前期通过单因素实验，初步优化处方，发现HA的浓度、HSA的浓度、HSA的pH值对载药纳米粒中DOX的包封率影响较大，采用Box-Behnken Design法优化处方条件，确定最佳制备处方。透析法考察药物的体外释放行为，相比于游离DOX，纳米粒具有明显缓释效果，再加入HAase孵育组，纳米粒中药物释放更快，证明了HAase可降解纳米粒中的HA，使纳米粒结构部分崩解，药物释放更多。体外溶血实验表明，纳米粒子无明显溶血性，可以用于静脉注射给药。体外细胞毒性实验结果表明，空白纳米载体HSA-HA NPs对4T1细胞无明显毒性，表明HSA-HA NPs的生物相容性较好，可作为一种安全无毒的纳米载体用以负载药物。同一药物浓度下，与DOX-HSA NPs相比，DOX-HSA-HA NPs的抗肿瘤活性更强，细胞内吞能力更强，揭示HA赋予了纳米粒的主动靶向性。

根据资料研究，普通阿霉素注射剂的用量为一次50～60 mg，但在使用过程中，会发生诸如心脏毒性，血小板和白细胞减少等毒副作用。目前经FDA已批准上市的阿霉素脂质体（Doxil?），其包封率约为90%，一次性剂量为20 mg，相比于普通的阿霉素注射剂来说，临床用量明显减少。本试验所制得的阿霉素白蛋白透明质酸纳米粒包封率为88.85%，符合中国药典要求，且与市售阿霉素脂质体的包封率接近，在临床应用上，可参考阿霉素脂质体，其用量也会大幅少于普通的阿霉素注射剂，并且，本研究所制得的纳米粒，在透明质酸的主动靶向作用下，可以提高抗肿瘤效果，因此使用剂量也会进一步减少。本研究为制备一种低毒副作用、高效新型DOX纳米制剂提供了一定的研究思路和实验基础。

参 考 文 献

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