猪圆环病毒3型研究进展

曹旭阳,袁 红,孙 普,李 坤,杨宇轩,邓欣雨,焦云娟,白兴文,卢曾军,权富生

(1. 西北农林科技大学动物医学院,陕西 杨凌 712100 ; 2. 中国农业科学院兰州兽医研究所,甘肃 兰州 730000)

猪圆环病毒(Porcine circoviruses,PCV)属于圆环病毒科、圆环病毒属成员,是无囊膜、共价闭合环状的单股DNA病毒,呈二十面体对称,其直径约17 nm。PCV是目前已知的能够在哺乳动物细胞中复制的最小的DNA病毒之一。目前,已经鉴定出4个基因型的PCV,包括 PCV1、PCV2、PCV3和 PCV4。1974年,在猪肾细胞系(Porcine kidney-15,PK-15)中发现了引起非细胞病变的细胞培养污染物,直至1982年,才证实其是一种病毒,命名为PCV1[1]。然而,目前还没有PCV1相关的临床疾病报道,因此推测PCV1是非致病的。20世纪90年代,在加拿大首次发现PCV2,最初被鉴定为断奶后多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的致病原[2]。此外,PCV2还与猪的多种临床症状有关,统称为猪圆环病毒相关疾病 (PCV-associated disease,PCVAD),包括猪皮炎与肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、繁殖障碍和呼吸系统疾病。2016年,美国学者发现了一种临床症状为受孕率下降、木乃伊胎和死胎率增加的猪病,通过免疫组化和定量聚合酶链反应排除了若干病原,包括PCV2、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)和猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV);随后宏基因组分析结果显示,致病原为一种新的猪圆环病毒基因组,进一步测序表明,病毒基因组由2 000个核苷酸组成,其衣壳蛋白与PCV2衣壳蛋白的氨基酸同源性为26%,因此,将此新的PCV命名为PCV3[3]。2019年,在患有呼吸道疾病和腹泻的7周龄猪的样本中检测到PCV4[4]。PCV3已遍及全球各个国家,引起了各国学者的广泛关注和研究,其与PCV2较为相似。现今对PCV2病原学、流行病学、预防和控制等方面的研究较多,也已开发出较好的诊断产品和疫苗对其进行防控。本文从PCV3的病原学、流行病学、临床症状、致病机理、免疫反应和诊断方法进行总结,为进一步深入研究PCV3的致病机理和开发预防性生物制品提供参考。

1 PCV3病原学

所有PCV具有相似的基因结构,均由含2个方向相反的开放阅读框(Open reading frame,ORF) 的闭合环状单股DNA基因组组成。PCV3病毒粒子直径介于13～25 nm,其基因组大小约2 000 bp,主要由ORF1、ORF2和ORF3组成,ORF1编码由297个氨基酸(Amino acid,aa)组成的复制酶(Replicase,Rep)蛋白,基因长度为891 bp;ORF2编码由214个aa组成的衣壳(Capsid,Cap)蛋白,基因长度为645 bp;ORF3编码由231个aa组成的功能未知的蛋白,基因长度为693 bp。PCV2病毒粒子直径介于14～17 nm,其基因组大小为1 767 bp或1 768 bp,ORF2(702 nt或705 nt)编码Cap蛋白。PCV3与PCV家族其他成员的基因组相似性较低,已有研究表明,PCV3与PCV1、PCV2和PCV4的核苷酸相似性分别约为45.5%、46.8%和43.2%[5]。

Cap蛋白是PCV的主要结构蛋白,其所存在的抗原表位能够诱导机体产生特异性免疫反应,因此,Cap蛋白一直是开展PCV免疫机理和疫苗研究的主要靶点。序列比对分析显示,PCV3 Cap蛋白与PCV1、PCV2和PCV4 Cap蛋白的氨基酸相似性分别约为24%、26%～36%和24.5%,表明PCV Cap蛋白的氨基酸相似性较低,故推测不同基因型Cap蛋白交叉保护性较弱。对PCV Cap蛋白的研究表明,60个Cap蛋白亚单位能够自我组装成病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP),该VLP与PCV一样,具有T=1的二十面体对称结构;冷冻电镜解析结构显示,与PCV2 VLP相比,PCV3 VLP 的β折叠桶核心区域(如72～79 aa和109～131 aa)的柔性区域发生了显著变化,表明PCV3 VLP的构象灵活性增加;此外,与PCV2 Cap蛋白相比,PCV3 Cap蛋白的N末端部分结构灵活性增强[6]。根据PCV3 Cap蛋白的第24、27位氨基酸突变分型结果,PCV3可分为PCV3a、PCV3b和PCV3c三种基因亚型。根据完整的(ORF1+ORF2)编码序列,PCV3a可进一步分为PCV3a-1、PCV3a-2和1个中间进化支PCV3a-IM。对我国多个省份的PCV3研究表明,3种基因亚型PCV3均存在,主要流行的基因亚型为PCV3b[7]。

2 PCV3流行病学

PCV3与PCV2在流行病学方面相似,两者均存在于家猪、野猪、牛、蚊虫、家蝇、绵羊和啮齿动物中,传播途径包括水平传播和垂直传播。

猪是PCV3的天然宿主,但是在其他家养动物和野生动物中也检测到了PCV3的存在,包括牛、狗、小鼠、羚羊、狍子、野猪、蜱和蚊子等,目前还没有证据表明这些物种在PCV3传播中起作用。据报道,麂和狍也可以感染PCV3,但感染率较低[8]。在野生啮齿动物(如黄颈鼠、林鼠和田鼠)的样本中未检测到PCV3,意味着野生啮齿动物可能没有在PCV3的传播中发挥作用[9]。野猪被怀疑是PCV3的重要宿主之一,因为流行病学报告显示,野猪群PCV3感染率比一些家养猪群更高。研究发现,蜱中能否检测到PCV3与该地区是否存在野猪相关,在野猪存在地区的蜱中能够检测到PCV3,反之则不能够检测到,表明野猪可能影响PCV3向蜱的传播[8,9]。同样,从PCV3阳性猪场捕获的蚊子中也能检测到PCV3,而且蚊子和猪中的PCV3核苷酸序列具有100%的相似性[10]。总体而言,PCV3的流行传播与家养动物和野生动物之间的关系比较复杂,有待进一步深入研究。

病猪和隐性感染猪是PCV3的主要传染源,在患病仔猪或隐性感染猪的脑、肾脏、心脏、脾脏、血清、胸腔积液、腹腔液、口腔液、鼻腔液、粪便和精液等几乎所有组织和体液中均可检测到PCV3的DNA。在有症状和无症状感染小猪的各种组织和器官中的可检测到PCV3特异性抗原,包括皮肤、肺脏、心脏、肾脏、淋巴结、脾脏、肝脏和小肠[11]。从妊娠后期母猪收集的38份初乳样品中,有17份(44.74%)检测结果为PCV3阳性[12]。这些结果表明,PCV3可以在猪只中水平传播,也可以垂直传播。

PCV3在世界多个国家广泛流行。2018年,德国猪群的PCV3阳性率为75%,波兰猪群的PCV3阳性率为86%[13],巴西9个州的PCV3阳性率为47.8%[14]。2006—2017年,从泰国26个养猪场获得样本的PCV3阳性率为36.70%[15]。2018年,韩国农场样本的PCV3阳性率为9.8%[16]。2016年,日本收集的猪群组织样本中PCV3阳性率为9.6%[17]。随后在意大利、瑞典、丹麦、俄罗斯和塞尔维亚等国家相继检测到PCV3的流行。1993—2007年,对瑞典采集的病料进行PCV3检测,结果显示,阳性率超过20%,且阳性样本最早可追溯至1993年[18]。西班牙的流行病学研究显示,早在1996年就存在PCV3感染[19]。

2016年,我国首次报道在广东省猪群中发现PCV3的感染[20]。2018年,对我国中部14个地区的猪场进行PCV3检测,结果显示,猪场阳性率为48.78%,猪只阳性率为31.18%[21]。2017年,我国东部11个地区猪场的样本检测结果显示,PCV3阳性率为34.7%[22]。2018年,我国华南地区的样品检测结果显示,PCV3猪场阳性率为48.78%,猪只阳性率为31.18%[23]。2017—2019年,对吉林地区10家规模化养殖场收集的704份样品进行PCR检测,结果显示,PCV2阳性率为42.0%,PCV3阳性率为34.2%,PCV2和PCV3混合感染率为22.7%[24]。2017—2019年,对广西地区482个规模化养殖场收集的917份样品进行检测,结果显示,PCV3在广西12个地区存在不同程度的流行,且具有逐年上升的趋势[25]。郑州地区PCV3的流行病学调查显示,2017—2019年该地区猪场PCV3总阳性率为14.6%,呈现逐年上升的趋势,其中2019年阳性率最高(19.5%)[26]。1990—1999年,对我国29个省份的病料进行回顾性检测发现,9个省PCV3检出率为6.5%,最早可以追溯到1996年[27]。以上结果表明,PCV3在国内广泛流行,给疫病防控带来巨大挑战。

3 PCV3临床症状

PCV3感染与多种临床症状相关。目前的研究发现,PCV3可导致多种疾病和综合征,其临床症状和PCV2相似。

3.1 生殖障碍和PDNS 研究表明,PCV3感染母猪会出现厌食症、PDNS样皮肤病变和母猪繁殖障碍(包括流产、木乃伊胎和死胎率增加以及受孕率下降),且死亡率增加,严重病变主要表现为多灶性丘疹、斑疹和浅表性皮炎,与PCV2感染所表现的PDNS没有区别[3]。在美国哥伦比亚某农场,分娩前的小母猪被确诊为PCV3阳性,其血清病毒滴度为7.4×103copies/μL,小母猪分娩时出现难产,产下1只木乃伊胎和10只小猪,其中2只小猪出现围产期死亡[28]。被PCV3感染的新生仔猪病例也表现如先前文献所报道母猪病例的症状,如间质性肺炎、肠系膜淋巴结出现淋巴样物质缺乏和肉芽肿性淋巴结炎[3]。

3.2 多系统炎症综合征 在PCV3相关研究中,最常见的临床症状是多系统炎症。美国首次报道的PCV3病例表现多系统炎症,包括淋巴浆细胞性心肌炎、间质性肺炎和急性支气管炎,但该炎症与PCV3临床表现的相关性仍不清楚。这些临床症状是非特异性的,组织学评估显示,多系统炎症在围产期和断奶仔猪中是一致的[29]。病毒检测证实了多系统血管炎存在于心脏、脾脏、肾脏和肝脏等的小血管内膜和中膜上,病毒感染在心肌炎中的作用已得到证实[30]。这些是否是PCV3发病机制的基础尚不清楚,因此,有必要进行进一步研究,以了解PCV3感染的完整发病机制和临床相关性,以及是否因合并感染而加剧临床表现或易于引起继发感染。

3.3 亚临床感染和混合感染 回顾性研究表明,PCV3的亚临床感染发生于所有年龄猪群,而且在未表现临床症状的猪只组织器官中也可检测到PCV3。除了在表现亚临床症状的母猪血清中检测到PCV3特异性抗体之外[31],在隐性感染猪的口腔液中也检测到了PCV3[5]。PCV3和多种猪病病原体混合感染病例被普遍报道,包括PCV2、PRRSV、PPV、猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪三角冠状病毒 (Porcine delta coronavirus,PDCoV)和猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)。在美国[32]、中国[33]、韩国[34]和欧洲[35],PCV2和PCV3的混合感染率介于1.26%～70.00%。在韩国[16]、中国[36,37]和泰国[15],PRRSV和PCV3的混合感染率介于0.67%～61.54%。我国东北地区PCV3与PPV2、PPV6和PPV7的混合感染率分别为8.6%、20.0%和24.8%[38]。在我国,PCV3与猪细环病毒1型(Torque teno suis virus 1,TTSuV1)、TTSuV2以及TTSuV1和TTSuV2混合感染率分别为83.3%、71.2%和50.0%[39]。尽管目前已经有大量文献报道了PCV3与其他病原体混合感染的情况,但是没有关于PCV3作为主要病原体或者非主要病原体的作用和由于混合感染导致病毒复制增加的信息,所有的研究仅停留在检测层面上。因此,建立和开发混合感染模型,有利于对引发临床疾病所需的辅助因子或者诱发因子进行深入的研究。

3.4 病毒血症 通过对病毒的检测发现,在病毒被完全清除之前,病毒血症会持续很长时间。对西班牙4个养殖场进行定期评估发现,病毒血症是间歇性的,其在整个生产周期中的阳性率介于6.5%～25.0%,表明存在PCV3长期持续感染的可能性[19]。有研究表明,母猪的PCV3载量与胎次有关,第2胎病毒载量明显高于第4胎,可能是由于整个生产周期中多次接触PCV3建立了免疫;在公猪中也发现,年轻公猪的病毒载量较高,其中小于12月龄公猪的病毒载量明显高于年老公猪[40]。

不同研究中所检测的PCV3基因拷贝数有所不同,一般在攻毒后3～21 d达到最大浓度,研究一致表明至少在攻毒后28 d方可检测到持续的病毒血症,在42 d之后仍然可以检测到病毒血症[41],与PCV2病毒血症的结果一致[42]。

4 PCV3致病机理

PCV3进入细胞的具体机制和相关受体仍然未知。在PCV3自然感染母猪的流产胎和木乃伊胎中,在心肌细胞、心脏和肾脏动脉的平滑肌细胞以及胎盘的滋养层中均检测到了PCV3的复制[29]。同样,在患有多系统炎症的断奶猪和育肥猪的心脏和肾脏动脉的平滑肌细胞中均检测到了PCV3 的复制[43]。此外,在育肥猪皮下脂肪细胞、大脑白质和灰质的小动脉平滑肌和室管膜细胞中也检测到PCV3[44]。在接种PCV3的6周龄猪中,除肾小管上皮细胞和肾脏中动脉的中膜外,心肌细胞和心脏动脉的中膜中也检测到了PCV3的复制,且通过免疫组化得到了证实[44]。此外,接种PCV3的 5周龄猪的相关研究表明,PCV3在肝窦内皮细胞、间质性心肌炎和皮质间质性肾炎相关的淋巴细胞、脾脏的白色髓质、小肠道集合淋巴结和肠浆膜炎症灶相关的淋巴细胞内复制[41]。4～8周龄无特定病原体猪的心肌细胞、肾小管上皮细胞、肝细胞和肝窦以及气管支气管、肠系膜和腹股沟淋巴结的皮质和髓质巨噬细胞呈PCV3抗体阳性反应[11]。库旭钢等[45]用PCV3阳性病料初始匀浆液和细胞培养物感染断奶仔猪后发现,PCV3主要感染扁桃体和淋巴结等免疫器官,脾脏、肺脏和扁桃体等组织中的病毒载量最高。总之,研究表明PCV3具有广泛的细胞嗜性,这些细胞可能存在某种促进PCV3进入和复制的共同受体。

尽管与受体和病毒进入细胞的机制相关的信息有限,但推测PCV3和 PCV2的机制不同。在PK-15细胞中证明,PCV3进入细胞主要通过网格蛋白和动力蛋白-2介导的内吞作用,且病毒复制依赖于Rab5和Rab7,其介导早期和晚期核内体运输,并影响酸性细胞质环境[46]。此外,核仁定位信号(Nucleolar localization signal,NoLS)和核仁磷蛋白1(Nucleophosmin 1,NPM1)相互作用促进了核定位。Cap蛋白氨基酸残基第1～38位直接与NPM1相互作用[47]。在NPM1的N末端寡聚化结构域中,第48位丝氨酸的电荷性质对于Cap与NPM1相互作用和亚细胞定位至关重要[48]。同时,NPM1上调可促进PCV3复制[47]。PCV3感染的复杂机制已经逐渐被揭开,然而对PCV3致病机制的进一步研究取决于稳定的细胞系,该细胞系应能够持续支持PCV3的复制和病毒的分离。

5 PCV3免疫反应

5.1 先天性免疫应答 先天免疫反应是由宿主通过模式识别受体和病毒DNA特有的病原体相关分子模式识别病毒,诱导干扰素的产生。体外研究结果表明,PCV3 Cap蛋白可通过Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)激活促炎细胞因子IL-6和TNF-α以及NF-κB信号通路[49]。在体内模型中评估先天免疫反应证明,类似于PCV2感染,PCV3感染对IL-8具有调节作用[41]。IL-10和大多数促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-4)在PCV2发病中是必需的,但是否影响PCV3感染仍需进行进一步的试验验证。Temeeyasen等[41]的研究结果表明,促炎细胞因子对PCV3感染是没有影响的,但Jing等[50]的研究结果与之相反,PCV3感染仔猪的促炎细胞因子和趋化因子的表达量显著上调。因此,需要进一步的研究来阐明PCV3感染期间宿主识别以及干扰素和趋化因子产生的分子机制。

5.2 体液免疫应答 目前,对PCV3体液免疫反应的研究主要是检测PCV3诱导的抗体的存在,对PCV3感染期间抗体的保护作用或者动力学水平的研究较少。Deng等[51]对我国猪场2015—2017年收集的猪血清进行检测,结果显示,PCV3阳性率从22.35% (2015年)上升到51.88% (2017年)。研究表明,猪PCV3阳性抗体率和病毒血症呈正相关[31]。多个农场的研究结果显示,6周龄以上猪只PCV3阳性率的检测是有变化的,到24周龄时阳性动物的数量明显增加,可能是由于母源抗体可以保护年幼的动物,但是随着年龄的增加,母源抗体水平下降,阳性动物的比例增加[19]。Stadejek等[52]的研究结果也表明,在3～4周龄猪只中未检测到病毒血症。总之,这些研究结果表明,PCV3具有与PCV2类似的母源抗体动态,猪群母源免疫大约在6～10周龄消失,随后在后期保育和早期生长阶段,PCV3感染动物的比例增加。需要更多研究来证实PCV3母源抗体的存在和活性及其在群体感染动力学中的潜在作用。

5.3 细胞免疫应答 PCV3感染细胞介导的免疫反应目前仍不太清楚。用PCV3感染性物质结合钥孔血蓝素(Keyhole limpet hemocyanin,KLH) 接种5周龄猪只,未产生合适的细胞反应,因此,在T细胞亚群中未观察到差异,包括细胞毒性T细胞(CD4-CD8+high)、辅助性T细胞(CD4+CD8-)、调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+)和记忆性T细胞(CD4+CD8+low)[41]。Jiang等[11]的研究结果显示,PCV3感染结合植物血凝素(Phytohemagglutinin,PHA)抑制了外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)增殖,导致淋巴细胞增殖减少[11]。类似的结果在PCV2感染中也可观察到,其中,PBMC对超抗原或促有丝分裂剂的反应较低或无反应。Arruda等[29]所进行的PCV3感染组织评估结果显示,大部分淋巴细胞内流与T细胞群相关,表明T细胞群的不平衡发生在受感染的组织中,并不会转化成系统性变化。

6 PCV3诊断方法

6.1 直接检测方法 目前,已经开发了几种PCV3的PCR诊断分析方法,包括TaqMan探针实时荧光定量PCR(TaqMan-based real-time PCR)、SYBR Green 实时荧光定量PCR(SYBR green-based real-time qPCR) 和直接PCR,均可检测到最低含量为102拷贝数以下的病毒[53]。Zou等[54]研究开发的液滴数字PCR可以检测到1个拷贝数的PCV3病毒含量。重组酶聚合酶扩增(Recombinant polymerase amplification,RPA)和环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与qPCR的灵敏度相当[55]。最近有研究使用等温扩增原理结合指示染料甲酚红和酚红,可以进行视觉比色以检测PCV3[56]。

由于PCV3存在与猪的其他病毒共感染的情况,现已开发出几种可以同时检测PCV3与多种猪病病毒的多重qPCR方法,且具有与单重qPCR相当的灵敏度。Chen等[57]开发的四重qPCR可以同时检测PCV1、PCV2、PCV3和PCV4,灵敏度与单重qPCR相当。吴江等[58]建立的基于TaqMan探针的双重qPCR检测方法可用于PCV2和PCV3的检测,具有很好的特异性和敏感性。Liu等[59]开发的液滴数字双重PCR可用于PCV2和PCV3的检测,检测限分别为2拷贝/μL和1拷贝/μL。还有研究利用RNAScope平台开发检测方法,用探针靶向PCV3ORF1 mRNA序列进行检测[29,41]。

6.2 间接检测方法 为了检测PCV3的特异性抗体,现已开发了多种ELISA检测方法。目前,大多数ELISA检测方法是基于大肠杆菌表达系统,表达去除N末端的核定位序列的截短肽,将其作为包被抗原[44]。王俊伟等[60]建立的基于PCV3-Cap蛋白的间接ELISA检测方法具有很好的特异性,与PCV2、CSFV、PRV和PRRSV均无交叉反应。现有的ELISA检测方法都是针对PCV3 IgG开发的,而Mora-Díaz等[44]开发了基于PCV3 IgM的ELSIA检测方法。

7 总结和展望

本文就当前PCV3病原学、流行病学、临床症状、致病机理、免疫反应和诊断方法6个方面的研究进展进行了总结。目前,对PCV3研究的不足之处主要包括:(1)病毒在亚临床感染中的作用;(2)持续病毒血症和病毒在环境中永久存在的作用;(3)病毒在共感染中的作用;(4)病毒引发的不同的临床表现。这些都是未来需要重点关注和研究的内容。

PCV3对养猪业有严重影响,目前其致病机理和传播机制尚不太清楚,防治技术也不完善,需要畜牧兽医技术人员的不断努力,对病毒进行全方位研究,攻克该病毒的传播和清除问题,以保障养猪业的健康发展。