正交试验优化苦豆子复方抗白色念珠菌物质的醇提工艺

王福玲,高 原,盛洁静,王冬雪,王金宏,王 昊,韩晓宇,辛国松,3,杨 波,4

(1. 哈尔滨商业大学药学院,黑龙江 哈尔滨 150076 ; 2.浙江上药九旭药业有限公司,浙江 金华 321016 ;3. 教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心,黑龙江 哈尔滨 150076 ; 4. 黑龙江省预防与治疗老年性疾病药物研究重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150076)

畜牧业集中养殖家禽时,若环境不卫生,容易引起真菌感染。在机体免疫能力下降或菌群失衡时,白色念珠菌感染可引发皮肤炎、阴道炎、甲沟炎、口疮、肺炎和肠胃炎等常见炎症。通过查阅文献可知,苦豆子复方具有抑制白色念珠菌的作用[1]。为更好的发挥苦豆子复方治疗和防御炎症的效果,本试验主要以醇提的方法提取苦豆子复方中抗白色念珠菌物质,以最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)值为评价指标,在单因素考察基础上,采用正交设计筛选最佳提取工艺,得出苦豆子复方中抗白色念珠菌物质的最佳提取工艺,从而为其在医药和日用化学等行业中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 细菌与药材 苦豆子、蛇床子、黄柏,均购自哈尔滨市中药材市场,经哈尔滨商业大学药学院中药教研室鉴定分别为豆科植物苦豆子SophoraalopecuroidesL.的种子、伞形科植物蛇床Cnidiummonnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果实、芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮。白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC10231,购自黑龙江省微生物研究所。

1.2 主要试剂 95%乙醇(批号为20170608),购自天津市天力化学试剂有限公司;蛋白胨(批号为20190308)、酵母膏(批号为20180430),均购自北京奥博星生物技术有限责任公司;葡萄糖(批号为20180711),购自国药集团化学试剂有限公司;生理盐水(批号为170525D1),购自哈尔滨三联药业股份有限公司。

1.3 主要仪器 电子分析天平(型号为BSA6202S-CW),赛多利斯科学仪器有限公司;数显恒温水浴锅(型号为HH-2),江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;循环水式多用真空泵(型号为SHB-3),郑州长城科工贸有限公司;高效万能粉碎机(型号为B-56-2),天津泰斯特仪器有限公司;超声波清洗机(型号为HS-20D),上海新芝生物技术研究所;精密恒温培养箱(型号为BP-9082)、电热鼓风干燥箱(型号为DHG-9070A),上海一恒科学仪器有限公司;紫外超净工作台(型号为AC2-4S1 HDL),北京东联哈仪器制造有限公司。

1.4 培养基的配制 取10.00 g蛋白胨和5.00 g酵母膏于具塞锥形瓶中,加蒸馏水定容至400 mL,搅拌均匀后进行高压蒸汽灭菌(121 ℃,20 min);另取10.00 g葡萄糖,加蒸馏水定容至100 mL,搅拌均匀后进行高压蒸汽灭菌(115 ℃,15 min),最后将2种溶液混合,即为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(Yeast peptone dextrose medium,又称YPD液体培养基)。

1.5 菌悬液的配制 从生长白色念珠菌的固体培养基上挑选状态较好的白色念珠菌单菌落,接种于YPD液体培养基中,30 ℃条件下恒温培养24 h后,取出菌液,稀释至105CFU/mL,备用。

1.6 单因素试验 (1)温度(A)对提取的影响:以MIC为指标,按1∶1∶1的比例称取苦豆子、黄柏、蛇床子各1 g,以料液比1∶10用75%乙醇分别在60、70、80、90 ℃和100 ℃条件下提取1 h。(2)料液比(B)对提取的影响:以MIC为指标,按1∶1∶1的比例称取苦豆子、黄柏、蛇床子各1 g,分别以料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25用75%乙醇在80 ℃条件下提取1 h。(3)时间(C)对提取的影响:以MIC为指标,按1∶1∶1的比例称取苦豆子、黄柏、蛇床子各1 g,以料液比1∶10用75%乙醇在80 ℃条件下分别提取0.5、1.0、1.5、2.0 h和2.5 h。(4)次数(D)对提取的影响:以MIC为指标,按1∶1∶1的比例称取苦豆子、黄柏、蛇床子各1 g,以料液比1∶10用75%乙醇在80 ℃条件下分别提取1、2、3、4次和5次。(5)乙醇体积分数(E)对提取的影响:以MIC为指标,按1∶1∶1的比例称取苦豆子、黄柏、蛇床子各1 g,以料液比1∶10分别用55%、65%、75%、85%和95%乙醇在80 ℃条件下提取1 h。

1.7 正交试验 综合单因素试验结果,选取5个单因素中具有代表性的3个水平来进行正交试验,按L18(37)正交表安排试验,以MIC值为指标。

1.8 最小抑菌浓度(MIC)的测定 干燥好的苦豆子复方提取物加生理盐水配制成40 mg/mL的溶液,采用96孔板2倍稀释法测定MIC值。取一96孔板,在第1、2列的B孔及以下的每个孔中加入生理盐水100 μL,向A1～A2孔中加入已配制好(浓度40 mg/mL) 的苦豆子提取物溶液200 μL,混匀后从第1行A孔中吸取100 μL待测溶液加入第2行B孔中,以此类推,加至第7行G孔,从G孔中吸取100 μL溶液打入废液缸。在第1列每个孔中加液体培养基100 μL,作为对照组,在第2列每个孔中加入菌液100 μL,作为试验组。其他各列分别按上述操作加入各个药液,将制备好的96孔板置于30 ℃恒温培养箱中培养18 h,观察菌液生长情况,菌液透明澄清时所对应的药液浓度即为MIC。

1.9 验证试验 用正交试验所得的最佳提取条件,重复3次,测定MIC值,验证提取工艺。

1.10 数据统计与分析 使用SPSS 16.0软件对试验数据进行统计与分析。

2 结果

2.1 单因素试验 结果如图1所示,在温度为60、70 ℃和80 ℃时MIC值较小,所以选取这3个提取温度进行正交试验;当料液比为1∶15、1∶20和1∶25时MIC值较小,所以选取这3个料液比进行正交试验;当时间为1.5、2.0 h和2.5 h时MIC值较小,所以选取这3个提取时间进行正交试验;当提取次数为1、2、3次时MIC值较小,所以选取这3个提取次数进行正交试验;在乙醇体积分数为55%～65%时MIC值较小,抑菌效果好,所以选取乙醇体积分数55%、60%和65%这3个水平进行正交试验。

图1 各单因素对苦豆子复方醇提取MIC的影响Fig.1 Effects of single factors on the MIC of alcohol extraction of Kudouzi compound

各因素选取3个较低水平进行五因素三水平的正交试验,见表1。

2.2 正交试验 结果如表2所示,苦豆子复方醇提取的最佳工艺条件为A1B2C2D1E3,即提取温度为60 ℃,料液比为1∶20,提取时间为2.0 h,提取次数为1次,乙醇体积分数为65%,抑菌效果好。方差分析表明,5个因素对苦豆子复方抗白色念珠菌影响的主次顺序为A>B>D>C>E。

表2 L18(37)正交试验分析结果Table 2 Result of L18(37) orthogonal design analysis

从表3可知,提取温度(A)和料液比(B)显著影响苦豆子复方醇提物抑菌效果(P<0.05),其他因素对醇提物的MIC值无显著影响(P>0.05)。

表3 方差分析结果Table 3 Result of the variance analysis

2.3 验证试验 用正交试验所得的最佳提取条件,重复3次,提取的苦豆子复方抗白色念珠菌物质的MIC值均为1.25 mg/mL,由此可知,本试验所得苦豆子复方抗白色念珠菌物质的最佳提取工艺数据稳定可靠。

3 讨论

白色念珠菌是较为常见的真菌感染致病菌,临床上的抗真菌药品多为西药,大量应用会导致真菌耐药性的增多,使得真菌感染的治疗越发困难。中药具有有效、副作用小、不易产生耐药性等优点[2]。已有研究表明,复方苦豆子栓剂、复方苦参洗剂、蛇床子苦参散等中药复方制剂在临床上具有良好的抑菌疗效[3-5]。本试验以现有的中药复方制剂为基础,通过各中药协同增效,优化制备工艺,得到治疗白色念珠菌效果较好的苦豆子复方物质,使其更好的用于治疗。

苦豆子和黄柏大苦大寒,具有清热燥湿、解毒疗疮、杀虫止痒止痛之功[6-7];蛇床子寒中有温、温而制寒,具有以温阳利湿之功[8]。中药有效成分如生物碱具有很强的抗菌效应[9-10]。复方不但能增强各单味药特有的功效还能改善其他病症,符合协同给药规律。

不同的提取方法对有效成分影响很大,本试验对苦豆子复方抗白色念珠菌的提取工艺进行正交试验优化,得出最佳提取工艺为20倍的65%乙醇,在温度为60 ℃的条件下,提取2.0 h,提取1次,此时得到的提取物具有较好的抗白色念珠菌活性。本试验为深入研究苦豆子抗菌机理提供了数据支持。另外,苦豆子、蛇床子和黄柏来源广泛、经济价廉、安全性高、副作用小,具有很大的开发价值,但其有效成分和抗菌机理有待进一步研究。