基于吕氏泰勒虫4种靶基因的PCR检测方法比较

田万年,李 奇,宁宇春,杜秋明,郑秀红

(1. 吉林农业科技学院动物科技学院,吉林 吉林 132101 ; 2. 延边州动物疫病预防控制中心,吉林 延吉 133000 ; 3. 龙井市德新乡综合服务中心,吉林 龙井 133400)

羊泰勒虫病是由泰勒科、泰勒属的原虫寄生于羊的红细胞和淋巴细胞所引起的一种血液原虫病[1]。本病对羔羊和外地引进羊危害严重,病羊感染后临床症状多表现为消瘦、贫血、黄疸和血红蛋白尿,本地羊多表现为带虫免疫[2]。我国已报道的可感染羊的泰勒虫主要有吕氏泰勒虫(Theilerialuwenshuin)、尤氏泰勒虫(Theileriauilenbergi)和绵羊泰勒虫(Theileriaovis)[3]。吕氏泰勒虫病病原检测主要依靠血液涂片镜检,由于隐性感染羊的血液染虫率较低,血液涂片检测易漏诊或误诊,PCR检测方法具有更高的特异性和敏感性,对病原体的诊断更加可靠、准确。

目前,用于吕氏泰勒虫病PCR检测的靶基因有核糖体小亚基RNA(Small subunit ribosome RNA,18S rRNA)基因、主要表面蛋白(Major piroplasm surface protein,MPSP)基因、内转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)基因和线粒体细胞色素C氧化酶1(Cytochrome C oxidase subunit 1,Cox1)基因[4-8]。本试验选取以上4种靶基因对吕氏泰勒虫进行PCR检测,对比不同靶基因PCR检测方法的特异性和敏感性,通过对45份临床绵羊血液样本进行PCR检测,筛选出吕氏泰勒虫最佳PCR检测方法用于该病的诊断和流行病学调查。

1 材料与方法

1.1 样本来源 绵羊血液样本于2019年6月采自吉林省图们市散养绵羊,共45份,同时制作血液涂片,吉姆萨染色镜检。吕氏泰勒虫阳性DNA由本实验室分离并保存[9]。中华泰勒虫DNA、附红细胞体DNA和卵形巴贝斯虫DNA由延边大学薛书江博士惠赠。

1.2 主要试剂 血液基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和DL2 000 DNA Marker,均购自宝日医生物技术(北京)有限公司;TaqPreMix,购自于天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 主要仪器 高速低温离心机(5810R),德国艾本德公司;PCR仪(9700),美国ABI公司;琼脂糖水平电泳槽(DYCP-31C)和凝胶成像分析系统(WD-9413B),均购自北京六一生物科技有限公司。

1.4 引物的设计和合成 根据参考文献[5-8]合成吕氏泰勒虫18S rRNA、MPSP、ITS和cox1基因引物,筛选出检测吕氏泰勒虫的最佳靶基因。根据GenBank上吕氏泰勒虫18S rRNA序列(登录号:AY262119)设计5对引物(表1),筛选扩增18S rRNA基因的最佳引物。所有引物均由吉林省库美生物科技有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer details

1.5 血液DNA提取 采用血液基因组DNA提取试剂盒提取羊血液样本基因组DNA,取5 μL提取的基因组DNA,通过1%琼脂糖凝胶电泳检测,凝胶成像分析系统拍照记录。

1.6 PCR扩增 基于18S rRNA、MPSP、ITS和cox1基因的PCR反应体系(25 μL):ddH2O 9 μL,TaqPreMix 12.5 μL,基因组DNA 2.5 μL,上、下游引物各0.5 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性3 min;94 ℃变性45 s,56～60 ℃ 退火45 s,72 ℃延伸30 s,34个循环;72 ℃延伸7 min。不同靶基因阳性PCR产物分别胶回收后,连接到pMD-19T载体,转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞中,提取质粒DNA进行PCR鉴定,鉴定为阳性的重组质粒送往吉林省库美生物科技有限公司测序。

1.7 特异性试验 以吕氏泰勒虫、中华泰勒虫、卵形巴贝斯虫和附红细胞体DNA为模板,分别应用4对引物进行PCR扩增,分析不同靶基因PCR检测方法的特异性。

1.8 敏感性试验 分别对吕氏泰勒虫4种靶基因重组质粒DNA进行浓度测定,换算成拷贝浓度,将4种质粒DNA按10倍倍比稀释。分别进行4种靶基因的PCR扩增,对比不同靶基因PCR检测方法的敏感性。

1.9 18S rRNA基因PCR扩增引物筛选 经鉴定18S rRNA基因为吕氏泰勒虫PCR检测最佳靶基因,对18S rRNA基因PCR扩增最佳引物的特异性和敏感性进行检测,筛选最佳引物。

1.10 临床样本检测 应用不同靶基因的4对引物,对45份绵羊血液样本进行PCR检测,比较4种靶基因PCR检测方法的检出率。

2 结果

2.1 血液涂片镜检 羊血液涂片经吉姆萨染色镜检,可见红细胞内有梨籽形、圆点形虫体,初步鉴定为羊泰勒虫(图1)。

图1 血液涂片吉姆萨染色镜检(1 000×)Fig.1 Giemsa staining microscopic examination of blood smears (1 000×)A:羊泰勒虫; B:红细胞A:Ovine Theileria; B:Red blood cell

2.2 血液DNA提取 提取的基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳检测条带较清晰,可用于下一步试验(图2)。

图2 基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测Fig.2 Agarose gel electrophoresis detection of genomic DNAM:DL2 000 DNA Marker; 1～4:血液样本编号M:DL2 000 DNA Marker; 1-4:Blood sample numbers

2.3 特异性试验 以4种寄生虫阳性DNA为模板,分别用吕氏泰勒虫4种靶基因的PCR引物进行PCR检测。结果如图3所示,4种靶基因引物均只可扩增出吕氏泰勒虫DNA,扩增不出卵形巴贝斯虫、中华泰勒虫和附红细胞体DNA,具有较好的特异性。

图3 不同靶基因的4种PCR检测方法的特异性试验Fig.3 Specificity test of four PCR detection methods based on different target genesA:18S rRNA基因; B:MPSP基因; C:ITS基因; D:cox1基因(M:DL2 000 DNA Marker; 1:吕氏泰勒虫; 2:附红细胞体; 3:中华泰勒虫; 4:卵形巴贝斯虫)A:18S rRNA gene; B:MPSP gene; C:ITS gene; D:cox1 gene(M:DL2 000 DNA Marker; 1:Theileria luwenshuin; 2:Mycoplasma suis; 3:Theileria sinensis; 4:Babesia ovata)

2.4 敏感性试验 以18S rRNA、MPSP、ITS和cox1为靶基因的重组质粒DNA浓度分别为41.17、14.74、1.36和0.69 ng/μL。调整重组质粒DNA浓度并10倍倍比稀释,使4种靶基因重组质粒浓度均为9.82×102～9.82×109copies/μL。以相同拷贝数的不同靶基因的质粒DNA为模板,分别进行PCR检测,结果如图4所示,以cox1为靶基因最低检测量为9.82×105copies/μL,敏感性最低;以18S rRNA为靶基因最低检测量为9.82×103copies/μL,敏感性最高。

图4 不同靶基因的4种PCR检测方法的敏感性试验Fig.4 Sensibility test of four PCR detection methods based on different target genesA:18S rRNA基因; B:MPSP基因; C:ITS基因; D:cox1基因(M:DL2 000 DNA Marker; 1～8:分别为9.82×109～9.82×102 copies/μL)A:18S rRNA gene; B:MPSP gene; C:ITS gene; D:cox1 gene(M:DL2 000 DNA Marker; 1-8:9.82×109-9.82×102 copies/μL,respectively)

2.5 18S rRNA基因PCR扩增引物筛选 以吕氏泰勒虫阳性DNA为模板,将相同浓度的DNA分别用已设计的5对引物进行PCR检测,结果如图5所示,以引物P3和P1特异性好,无杂带,扩增效果较好;引物P1、P2和P4出现杂带,PCR扩增效果不理想。

2.6 18S rRNA基因PCR扩增的特异性试验 分别以吕氏泰勒虫、中华泰勒虫、附红细胞体和卵形巴贝斯虫DNA为模板,用引物P3和P1进行PCR检测,结果如图6所示,引物P3和P1均只可扩增出吕氏泰勒虫DNA,扩增不出卵形巴贝斯虫、中华泰勒虫和附红细胞体DNA,具有较好的特异性。

2.7 18S rRNA基因PCR扩增的敏感性试验 以吕氏泰勒虫重组质粒DNA为模板,经10倍倍比稀释重组质粒浓度为9.82×10～9.82×109copies/μL。用引物P1和P3进行PCR扩增,结果如图7所示,引物P3最低检测含量为9.82×102copies/μL;引物P1最低检测含量为9.82×103copies/μL,引物P3敏感性是引物P1的10倍。

2.8 临床样本检测 临床样本检测结果如表2所示,以18S rRNA为靶基因,引物P3的PCR检测方法的阳性率最高,阳性率为33.33%(15/45);以cox1为靶基因的PCR检测方法的阳性率最低,阳性率为22.22%(10/45);以MPSP和ITS为靶基因的PCR检测方法的阳性率均为26.67%(12/45)。

表2 临床样本的PCR检测结果Table 2 PCR detection results of clinical samples

3 讨论

在目前已建立的吕氏泰勒虫检测方法中,PCR方法具有敏感性高、特异性强等优点,可对吕氏泰勒虫病进行早期诊断,更适合临床检测。研究发现,PCR方法选择的靶基因不同,其敏感性和特异性存在较大差异[10-12]。本试验对以18S rRNA、MPSP、ITS和cox1为靶基因的4种吕氏泰勒虫PCR检测方法进行了特异性、敏感性和临床样本检测对比,结果显示,以18S rRNA为靶基因的PCR方法敏感性最高,比以MPSP为靶基因的PCR方法敏感10倍,比以cox1和ITS为靶基因的PCR方法敏感100倍。分析原因可能是18S rRNA为线粒体DNA,在生物体内含量高于其他基因含量。MPSP是梨形虫表面膜蛋白,是泰勒虫感染红细胞阶段虫体分泌的一种膜内蛋白,在其他阶段该蛋白含量较低,因此,其基因检测的敏感性低于18S rRNA,与金超等研究结果相类似[13]。本试验临床样本检测结果显示,以18S rRNA为靶基因的PCR检测方法对临床样本的阳性检测率最高,可能与该基因具有较高的保守性有关。本试验在筛选检测吕氏泰勒虫PCR方法最佳靶基因的基础上,对最佳靶基因18S rRNA的检测引物进行了筛选,在设计引物时根据18S rRNA基因特点,通过与其他虫体序列进行比对,上、下引物序列选择在可变区,使其具有较高特异性。18S rRNA基因引物筛选结果显示,引物P3在特异性和敏感性方面优于其他引物,是检测吕氏泰勒虫的最佳引物。

羊吕氏泰勒虫病在我国新疆维吾尔自治区、甘肃省、吉林省等19个省(直辖市)均有报道,感染率介于4.1%～80.0%[14-17]。随着养羊业的迅速发展,不同品种羊和羊肉产品的交流日趋频繁,羊泰勒虫病的流行区域正日益扩大,已成为严重威胁养羊业健康发展的重要疾病之一,应引起动物检疫部门重视,采取措施控制疾病的流行[18,19]。本试验对现有的羊吕氏泰勒虫靶基因序列,应用PCR方法进行了对比分析,筛选出18S rRNA基因为最佳靶基因,在此基础上对18S rRNA基因PCR检测引物进行筛选优化,为羊吕氏泰勒虫病的临床诊断提供了特异、敏感的PCR检测方法。