药企环境菌库在实际工作中的应用

郭心怡，林 燕*，曹长雷，陈文俊

1.华兰生物工程重庆有限公司，重庆 涪陵 408100；2.长江师范学院生命科学与技术学院，重庆 涪陵 408100

制药企业的洁净生产环境作为一种典型的受控环境，其运行和管理占据着非常重要的地位。

近年来，药品安全突发事件频繁发生，这些事件与洁净室的微生物控制存在着极为密切的联系。2011年实施的《药品生产质量管理规范（2010年修订）》修订了无菌药品附录[1]，对制药洁净生产环境提出了更加严格的要求，尤其在洁净环境监测的内容纳入2015年版《中国药典》[2]附录之后，法规对洁净环境监测的要求变得越来越高，这就要求制药企业，尤其是无菌制剂企业要投入更多的人力和物力对生产的洁净环境进行有效的监控，从而达到提高产品质量的目的。

1 材料与仪器

1.1 主要试剂

革兰氏染色液、4%氢氧化钾水溶液、氧化酶检测指示条、3%过氧化氢溶液、API 鉴定试剂盒、PCR扩增试剂、基因组DNA 提取试剂盒。

1.2 主要仪器

BSC-1000-Ⅱ-A2 生物安全柜、培养箱、显微镜、VITEK 2 COMPACT 全自动微生物鉴定系统、全自动快速微生物检测系统、RiboPrinter 全自动微生物基因指纹鉴定系统、梯度PCR 仪和核酸微量分析仪。

2 方法与结果

2.1 实验方法

收集从药品生产洁净区、制药用水系统、原辅材料等环境中检出的微生物，将其分离纯化后采用生化鉴定技术和基因型鉴定技术进行鉴定，然后保存并建立环境菌库，定期进行统计，分析各板块微生物的分布情况及变化，采取相应的措施，为微生物污染控制提供指导[3]。

2.2 完善性能测试

统计无菌灌装模拟试验洁净环境的微生物数据，根据微生物的种类和占比，选取2 种占比高且分属不同种属的微生物作为无菌灌装模拟中培养基促生长试验的指示菌。环境中微生物流动性强且高级别洁净环境中微生物的含量极低，可根据每年微生物的变化调整指示菌，以便于更全面地监测培养基对于环境中微生物的促生长能力。2020年无菌灌装模拟试验中增加了科氏葡萄球菌科氏亚种和巨大芽孢杆菌作为环境指示菌，2021年无菌灌装模拟试验中选择表皮葡萄球菌和巨大芽孢杆菌作为环境指示菌（见表1、表2）。

表1 2020年洁净环境检出的微生物占比

表2 2021年洁净环境检出的微生物占比

2.3 消毒剂效果评价

统计洁净环境的微生物数据，可知环境中微生物占比最高的为葡萄球菌属，其次为芽孢杆菌属。根据微生物的种类和占比，选取科氏葡萄球菌科氏亚种（Staphylococcus cohniisubsp.cohnii）、阿尔莱特葡萄球菌（Staphylococcus arlettae）、少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）、 云南微球菌（Micrococcus yunnanensis）、 克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）、蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycodes）作为测试菌株；消毒剂选用常见的75%乙醇、0.2%新洁尔灭溶液和0.05%的84 消毒液；将消毒液与高浓度的测试菌株作用1～15 min，发现常用消毒液对无芽孢的污染菌的消杀效果良好，而对含芽孢的污染菌的消杀效果不理想。基于环境中芽孢杆菌属微生物占比较高，且该类微生物耐极端环境能力强的特性，选取7.9%过氧化氢杀孢子剂对芽孢杆菌进行消毒效果测试。结果表明7.9%过氧化氢杀孢子剂对含芽孢的污染菌的消杀效果良好（结果见表3、表4）。

表3 6 种测试菌株消毒测试效果

2.4 环境微生物污染控制

结合消毒剂效果试验结果，对人员、设备和房间清洁消毒程序进行微生物调查，优化程序，采取严格的管理措施，并针对空间增设定期的过氧化氢熏蒸。经过1年的控制，观察发现微生物检出率和种类明显下降，特别是人源的G（+）球菌和难消杀的G（+）芽孢杆菌作为环境微生物控制的难点得到了显著的控制，降低了微生物的污染。微生物的检出率和种类数对比趋势见图1、图2。

图1 微生物检出率对比

图2 微生物种类数对比

2.5 制药用水系统质量控制

制药用水系统中的微生物主要来源于纯化水系统。对其中微生物的种类和占比进行统计分析[4]，发现主要为少动鞘氨醇单胞菌和皮氏罗尔斯顿氏菌（见表5）。随着企业对水系统质量控制要求的不断提高，2020—2021年持续监控数据显示菌落数正在稳步下降。通过对数据进行评估分析，可知提高对纯化水行动限控制的标准，可以优化纯化水系统质量管理。

表5 2020—2021年持续监控数据

2.6 生产工艺中微生物溯源

对原料袋表面清洗消毒调查中微生物的种类和占比进行统计，发现其主要为少动鞘氨醇单胞菌，这种菌是广泛存在于水源和环境中的微生物。结合原料袋表面清洗消毒工艺分析：微生物的主要来源与消毒效果、原料袋表面清洗水污染或带入有很大的关系。应当联合生产部、质量保证部启动微生物溯源调查，优化消毒剂、消毒方式、清洗消毒工艺，并挖掘根本原因，据此制定有效的控制措施，持续监控并加以改进（表6），加大对微生物污染的控制力度。

表6 2020—2021年持续监控数据

3 结论

如何对生产环境中微生物污染的控制进行有效监控，是制药企业需要应对的一个难题，这就需要其建立一套科学、严格的监督管理模式，从建立环境监测计划、收集、分离、鉴别环境污染菌以及鉴别数据的应用分析等方面入手实现对洁净环境中微生物污染的有效监控，以保证洁净环境处于生产所需的受控状态。

建立环境的监测计划，收集、分离、鉴别环境污染菌和鉴别数据的应用分析，可以找出生产中存在的微生物污染情况及其规律，从而更好地对生产过程进行控制，以满足药品GMP 的严格监管要求。首先，企业可以对通过生产洁净环境监控建立起的菌库数据进行分析和统计，从而为制药企业的相关工艺验证（例如无菌灌装模拟试验、消毒剂效果评价等）提供环境菌和有效的评价；其次，可以根据菌库数据和微生物溯源对制药的生产过程进行微生物风险分析，及时发现异常趋势，并采取有效的措施，降低微生物污染的风险，提高质量管理体系的有效性[5]；最后，持续不断地对环境菌库进行更新补充，形成动态管理的环境菌库，能够为洁净环境中的微生物控制提供有效的保障。

实验结果证实，对制药洁净生产环境进行监控、研究并建立环境菌库，在实际生产过程中非常有必要，发挥的作用也是强大且有效的。