肠道微生物对骨质疏松大鼠/小鼠调节作用机制的研究进展

秦 锐，郭 刚，张世峰，郭 健*

1.兰州大学第二医院疼痛科，甘肃 兰州 730030；2.兰州大学第二医院骨科，甘肃 兰州 730030

肠道微生物群由胃肠道中的基因组成分、产物和微生物组成，具有较为稳定的种群结构，该微生物群数量庞大，种类繁多。肠道菌群对健康具有积极的影响，例如，肠道菌群会诱导产生免疫调节因子，这些因子能够调节肠道炎症反应、加强细胞保护、维持屏障完整性和稳态等。其中，有益细菌是保障肠道功能稳定性的必要菌群，维持肠道处于动态平衡状态，起到储备营养、提高免疫力、对抗肠道微环境改变等作用。但同时，机体功能受到饮食不当、药物使用、细胞衰老、情绪焦虑等多种负面因素影响，导致肠道微生物群成分发生改变，人体内多项慢性疾病的发生风险增大，如糖尿病、肥胖、骨质疏松等[1]。肠道微生物会对宿主生理产生巨大影响，因此，以肠道微生物为目标靶点或诊断方向成为热门的研究主题。骨质疏松（OP）是以骨强度和骨密度下降为标志的骨骼疾病，病因多为机体衰老、糖皮质激素干扰或雌激素缺乏，容易改变骨结构、增加骨脆性，同时还伴随着剧烈疼痛、行为障碍，骨折发生的几率大大提高。当前已有明确的报道指出肠道微生物群的变化会影响到骨密度和骨结构。“骨微生物学”是一门将骨骼生物学与微生物学相结合的学科，但目前仍需对关于肠道微生物如何调节骨质疏松的论题进行深入的研究。本文通过阐述肠道微生物对骨质疏松大鼠/小鼠调节作用机制问题，以期为如何使用益生菌预防骨质疏松提供新思路。

1 肠道菌群与骨质疏松的关系

骨健康是确保成骨细胞和破骨细胞在一定程度上保持动态平衡，使机体在从成长到逐渐衰老的过程中保持相对稳定的骨骼微环境。当破骨细胞生成速率高于成骨细胞的生成速率时，会导致骨质流失，造成骨质疏松。OP 可分为两种形式：原发性或继发性，其具体属于哪种形式取决于它是作为自然衰老的过程(雌激素缺乏)还是疾病病理的过程。这两种形式都是由骨重建过程中的不平衡引发的，骨吸收/形成量明显低于骨丢失量，导致骨骼微环境发生变化。在OP 发生时，往往会表现出骨量低、骨小梁变薄、骨质流失等特征，骨折风险增大，严重性不可小觑。

肠道内细菌数量超过100 万亿，种类多达29 个细菌门。微生物群落的物种多样性与健康息息相关，微生物群通过产生必需的营养物质，消化其他无法消化的食物成分，促进免疫系统的成熟，有益于宿主的身体健康。微生物群群落组成的不健康失衡，称为生态失调，与多种代谢、炎症、肠道屏障受损密切相关。一旦发生菌群失调，将会对机体造成严重的影响。肠道菌群是肠道中非常重要的稳态成分，肠道菌群失调可以显著改变部分前体细胞活性，如巨噬细胞RAW264.7 等，该细胞能够诱导分化为破骨细胞，最终导致破骨细胞数量增加，同时骨髓中CD4+T4细胞占比降低，辅助免疫作用减弱。Metzger 等[2]通过给小鼠口服有害菌，发现该菌群会引发小鼠肠道炎性病症和骨质丢失。无菌小鼠的骨量均高于普通小鼠。Hathaway 等发现GF 小鼠比无特定病原体小鼠的骨密度高，将无特定病原体小鼠的肠道菌群移植给GF 小鼠，发现GF 小鼠骨密度下降。Li 等[3]发现对于由性类固醇诱导造成的小鼠骨丢失，GF 小鼠具有抵抗作用。

糖皮质激素（GCs）是一种有效的免疫调节药物，具有显著的副作用，包括由糖皮质激素引起的骨质疏松症（GIO）。GCs 会直接诱导成骨细胞和骨细胞凋亡，也会改变肠道菌群组成。尽管已知肠道微生物群有助于调节骨密度，但其在GIO 中具体起着什么作用尚未被研究过。Jonathan 等为了测试其相关性，给雄性C57/Bl6J 小鼠使用糖皮质激素（泼尼松龙，GC-Tx）造模8 周，使小鼠成为GIO 小鼠，同时饲以广谱抗生素，以耗尽微生物群，使得该小鼠骨小梁明显丢失。用益生菌（路氏乳杆菌）补充调节肠道微生物，可防止骨小梁的丢失。这充分体现了肠道微生物群对GIO 的需求，长期ABX 预防了GC-Tx诱导的骨小梁丢失。微生物群分析结果表明，糖皮质激素治疗改变了Verrucomicobiales 和Bacteriodales 门的丰度，随机森林分析表明，不同类群之间卟啉单胞菌科和梭菌目操作分类单元（OTU）的丰度存在显著差异。此外，将GC-Tx 小鼠的粪便移植给未经治疗的野生型WT 小鼠会导致其骨丢失，说明微生物群对于GIO 的治疗能够改善骨丢失。

2 动物品系选择

在肠道微生物与大鼠/小鼠骨质疏松之间的联系的相关研究中，常用的大鼠品系为Wistar 大鼠和SD 大鼠。常用的小鼠品系较多，包含C57BL6 小鼠、CB6F1 小鼠、SAMP6 小鼠、SAMR1 小鼠、ICR 小鼠、无菌小鼠等。在特殊的实验中，转基因小鼠也可以被用作试验模型，如纯合子敲除护骨素基因小鼠，随着鼠龄的增长OP 症状加强。其中，无菌小鼠凭借其自身无任何细菌、无任何病原微生物的优势，在实验中成为首选动物品系，但缺点是对饲养环境要求高，价格昂贵。

3 动物模型的制备

基于OP 发生的生理病理过程，常见的造模方式主要包括两种，即原发性和继发性OP 模型。其中原发性OP 模型造模方法主要包含雄鼠切除睾丸法、雌鼠切除卵巢法，大多数品系大/小鼠均可以使用该方法进行造模。继发性OP 多由疾病发生、药物干预等造成，包括常见的内分泌代谢OP 模型（链脲佐菌素+卵巢切除）和药物性骨质疏松模型（糖皮质激素造模）等，通过上述造模过程，诱发OP。实验室多用切除双侧卵巢诱发造模，其优点是造模手术操作简单，死亡率低，造模成功率高。

4 常用益生菌调节骨质疏松方式和作用机制

益生菌的定义为含有活的非致病性微生物的膳食补充剂。其中，多种细菌作为有益的益生菌得到了广泛应用，如肠球菌属、双歧杆菌、乳酸菌属等，少数酵母菌也具有益生菌特性。益生菌具有如下特征：在胃肠道系统中生存（耐酸和胆酸）、表型和基因型稳定性、与黏膜表面的黏附性、抗生素耐药性、抗菌物质的产生和抑制病原体的能力。此外，益生菌或其发酵产物不能对宿主产生危害，不得使用含有可传播耐药基因的细菌，除非对病原微生物进行诱导，引起免疫系统反应。研究表明补充益生菌对于骨组织微环境有潜在改善, 主要通过提升其数量和丰度来调节肠道酸碱度，影响其抗菌肽的分泌；通过增强宿主免疫功能和促进生成黏液来增强屏障功能, 但具体机制不详。许多研究已经开始利用动物模型来研究益生菌是否可以用于预防原发性和继发性骨质疏松性骨丢失。通过对原发性骨质疏松小鼠更年期（OVX）模型进行研究，发现添加多种不同的益生菌（罗伊氏乳杆菌ATCC 6475、副干酪乳杆菌（NTU 101）或植物乳杆菌（NTU 102）、鼠李糖乳杆菌GG、副干酪乳杆DSM13434、植物乳杆菌DSM 15312、DSM 1531 等），均能够有效改善OVX 模型鼠骨质疏松病症，骨体积分数、骨密度、骨小梁厚度和数量均明显上调，与空白对照组小鼠指标水平相当；骨质中RANKL 蛋白、TRAP5 m、皮质骨RNARANKL/OPG 比值均减少，血清吸收标志物c 末端肽和尿钙排泄分数也有所下降，而成骨细胞相关基因不变（见表1）。这些结果进一步为益生菌通过调节破骨细胞的吸收防止雌激素缺乏导致小鼠骨丢失的观点提供了支持。在非益生菌组中相关指标无明显变化，说明非益生菌无法改善OP。OVX 大鼠中股骨的成骨细胞减少但骨表面的破骨细胞增加。在对OVX 大鼠模型进行长双歧杆菌治疗16 周后，发现其骨密度增加，骨小梁数量增加、厚度也增加，破骨细胞受到抑制。这表明与小鼠OVX 模型类似，益生菌能够有效调节大鼠OVX 模型中的破骨细胞[4]。

表1 益生菌/非益生菌与骨质疏松动物模型中的骨骼健康的作用机制

5 结论

骨质疏松是一种发生率极高的骨骼并发症，鉴于此今后科研工作重心不仅要关注如何缓解骨质疏松，更需要重视对其的预防。益生菌能够正向调节肠道微环境，维持肠道菌群稳定性，提高骨密度，增加骨小梁的数量。但如何提升益生菌的丰度和定植，提高菌群作用效率，减少有害菌的入侵，帮助预防骨质流失等问题仍需要进行进一步研究。