基于叶绿素a 测定的监测方法研究与改进

何嘉伟

广东省东莞生态环境监测站，广东 东莞 523000

叶绿素a 是浮游植物、藻类及一些细菌中的重要色素，具有将光能转化为化学能的作用。当水体中叶绿素a 含量超标时，会导致藻类大量繁殖，引发赤潮，降低水体透明度，威胁生态环境并造成巨大的经济损失[5]。因此，测定水体中叶绿素a 的浓度，可以精准判断水体的富营养化程度，明确水体的光合作用能力及营养状况。

目前，叶绿素a 的测定方法主要有分光光度法[1]、荧光光度法和高效液相色谱法[2]。在实际操作中，分光光度法是比较常用的分析方法，然而，人们在运用分光法测定叶绿素a 浓度的过程中面临着不少困扰，如：以9+1 丙酮为参比溶液，样品吸光度出现负值情况；人工研磨操作费时费力，样品飞溅问题难以控制，操作误差较大；此外，使用丙酮作为提取液极易挥发，对实验人员身体伤害较大，且会污染环境。因此，有必要对分光光度法进行进一步探究，以便于测定水质中的叶绿素a 时更加高效且安全。

1 实验材料

1.1 试剂与材料

本次实验用水为新鲜制备的去离子水，用到的试剂及各材料情况见表1。

表1 使用试剂及材料情况登记表

1.2 仪器和设备

本实验所用到的仪器设备：CARY 60 紫外可见分光光度计（配10 mm 石英比色皿）；F6/10 手持式高速匀浆机；离心机TG16-WS；过滤装置HDG-6A。

2 实验方法

除以下实验部分外，本实验方法的具体实验内容均依据HJ 897-2017 规定[1]进行。

实验分为三部分：1）在测定过程中，将9+1 丙酮、经过针式滤器的9+1 丙酮及空白试验样品分别作为参比，分别在750 nm、664 nm、647 nm、630 nm处测量其吸光度。2）分别采用玻璃研磨杵和手持式高速匀浆机对样品进行研磨，使用9+1 丙酮将样品浸泡提取2 h，离心后，以经过针式滤器的9+1 丙酮为参比测量吸光度，计算实际样品结果[3]。3）采用玻璃研磨杵对样品进行研磨，使用9+1 丙酮和95%乙醇分别浸泡提取，离心后，再分别以经过针式滤器的9+1 丙酮和95%乙醇为参比测量吸光度[4-8]。

3 结果与讨论

3.1 空白试验

按照HJ 897-2017 的操作要求[9]，对空白试样进行过滤—研磨—浸泡提取—离心过滤等操作。鉴于9+1 丙酮在使用过程中极易挥发，样品经过研磨—浸泡提取—离心过滤后，样品管内的丙酮含量远低于9+1，含水量升高，同时纯度不高的丙酮中很可能含有黄色的丙酮酸，以9+1 丙酮为参比溶液，空白试样在750 nm、664 nm、647 nm、630 nm 处均出现了负值的异常情况。

本实验又以经过针式滤器的9+1 丙酮和试验空白样品分别为参比，对空白试样进行分析，发现各吸光度结果为负值的情况均得到了改善。不同参比溶液的空白试验测试结果见表2。

表2 不同参比溶液的空白试验测试结果

3.2 研磨方式

使用玻璃研磨杵手工研磨需要耗费大量的时间和精力，故而仅适用于小批量样品处理，难以满足高批量的实验需要。同时，手工研磨的不可控性，决定了样品研磨可能不均匀，会影响到实验结果的准确性和可重复性。此外，手工研磨需要较高的技术水平和极强的耐心，对人员操作水平的要求较高[10]。

本研究对使用玻璃研磨杵手工研磨方式与捣碎滤纸后使用手持式高速匀浆机的半自动研磨方式进行比较，测试不同研磨方式对实验结果的影响。

通过实验及数据比对发现，玻璃研磨杵操作简单，破壁充分，但费时费力，丙酮使用过程中挥发严重且溶液飞溅，有一定的安全风险；而使用手持式高速匀浆机操作简单，破壁充分，且省时省力，能够减少丙酮飞溅，有利于降低实验风险。其详细结果见表3。

表3 不同研磨方式的实际样品测试结果（单位：μg/L）

3.3 提取液种类

经查阅相关资料了解到，叶绿素a 可溶于丙酮、乙醇、乙醚等有机溶剂中，考虑到丙酮试剂受公安部管制且使用过程中存在安全风险，而乙醇容易获得且无毒安全，故本实验使用95%乙醇作为提取液与标准要求的9+1 丙酮提取液进行比对。

通过实验及数据比对发现，使用95%乙醇提取液的浸提效果与9+1 丙酮相当，同时也能解决参比溶液调零后吸光度为负值的问题。其详细结果见表4。

表4 不同提取液的实际样品测试结果（单位：μg/L）

4 结论

使用9+1 丙酮作为参比溶液时对空白试样进行测量和对比分析，发现其在750 nm、664 nm、647 nm、630 nm 处均出现了吸光度为负值的异常情况，而采用经过针式滤器处理的9+1 丙酮或空白样品作为参比溶液，可以有效改善空白试样的负值问题。

本文对比了使用玻璃研磨杵和手持式高速匀浆机两种不同研磨方式对实验结果的影响。研究结果表明，手持式高速匀浆机操作简单，效率高且更加安全，能够有效降低实验风险。因此，运用分光光度法时应使用手持式高速匀浆机进行研磨处理，以获得更加准确且可靠的实验数据。

经实验比对，使用95%乙醇与9+1 丙酮提取液浸提效果相当，故而，95%乙醇可取代受管制的丙酮用作提取试剂。此外，使用95%乙醇还能有效解决参比溶液调零后吸光度为负值的问题。因此，建议使用95%乙醇作为9+1 丙酮的替代试剂，应用于相关领域中。