藏药绿萝花中银椴苷的提取工艺研究

王洁雪，周 页，姚 莎，刘玉容

成都师范学院化学与生命科学学院，四川 成都 611130

藏药绿萝花是瑞香科结香属植物滇结香（Edgeworthia gardneri（Wall.）Meisn.）的干燥花蕾[1]，主要分布于西藏寒冷地带，对糖尿病、高血脂等疾病具有良好的预防和治疗效果[1-2]。绿萝花中含有黄酮、香豆素、多糖、三萜等主要活性物质[3]，其中，银椴苷在绿萝花中的含量较高[4]，可作为其指标性成分，但由于当前缺乏对此活性成分的富集纯化研究，故而本实验为这一宝贵的民间植物资源的大规模开发提供了参考依据。

1 实验

1.1 仪器与试剂

Waters 2695 型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；色谱乙腈，色谱甲醇（费顿控股有限公司）；其他试剂（市售分析纯）；绿萝花（成都荷花池中药材市场）；银椴苷，HPLC＞98%（成都康邦生物科技有限公司）；大孔树脂AB-8、NKA-9、X-5、D101 和NKA-Ⅱ（天津允开树脂科技有限公司）。

1.2 绿萝花提取液的制备

取绿萝花干燥花蕾10 g，粉碎后向其中加入120 mL 无水乙醇，回流提取两次，每次1.5 h，浓缩后得到绿萝花提取液。

1.3 银椴苷标准溶液的配制

称取银椴苷对照品1.08 mg，加入甲醇定容，配制成质量浓度为0.108 mg/mL 的银椴苷标准溶液。

1.4 色谱条件

色谱柱：Agilent Extend-C184.6×250 mm，5 μm；检测波长：313 nm；柱温：30 ℃；流动相：乙腈（B）-0.1%磷酸水溶液（A）为（32：68）；流速：1.0 mL/min；进样量10 μL。

1.5 藏药绿萝花提取液中银椴苷含量的测定

取5 mL 绿萝花提取液，加乙醇稀释定容至100 mL，按1.4 项色谱条件进行进样检测，计算银椴苷的含量。经测定绿萝花中银椴苷含量为2.52 mg/mL 。

1.6 大孔树脂的选择及预处理

选取5 种不同型号的大孔吸附树脂（AB-8、NKA-9、X-5、D101、NKA-Ⅱ），将其分别浸泡在95%乙醇中24 h 后湿法装柱，先后用95%乙醇和蒸馏水冲洗，至无醇味。然后分别用4%氢氧化钠溶液和5%盐酸溶液浸泡，后冲洗至中性即可，备用。

1.7 静态吸附与解吸能力考察

分别称取5 种已处理好的大孔吸附树脂各2.5 g，向其中加入20 mL 绿萝花提取液，振摇。2 h 后抽滤至干，即得到吸附液。再向吸附后的大孔树脂中加入87%的乙醇20 mL 对其进行解吸，抽滤后得到解吸液。将得到的吸附液和解吸液依照1.4 项的色谱条件进行进样检测，并计算吸附量、吸附率、解吸量、解吸率（公式如下）。筛选出最适合提取银椴苷的树脂。

式中：X 表示吸附量，mg/g；W 表示吸附率，mg/g；Y表示解吸量，mg/g；Z 表示解吸率，%；a 表示吸附前银椴苷的质量浓度，mg/mL；b 表示吸附后溶液中银椴苷的质量浓度，mg/mL；v 表示上样液体积，mL；c表示解吸液中银椴苷的质量浓度，mg/mL；V 表示解吸液体积，mL；m 表示树脂质量，g。

1.8 动态吸附考察

1.8.1 上样液质量浓度考察

取样品溶液配成质量浓度依次为2.5、2、1.5、1 mg/mL 的溶液，称取4 份已处理好的树脂10 g 湿法装柱，分别将上述溶液以1 mL/min 的速度上样，收集过柱液，依照1.4 项色谱条件进行检测，精选最佳上样液质量浓度。

1.8.2 上样液体积考察

考察上述得到的最佳质量浓度溶液的上样体积，方法同1.8.1，每10 mL 收集一管流出液，测定每管中银椴苷的质量浓度，以流出液含量达到上样液中银椴苷含量的20%作为泄漏点，精选出最佳上样体积。

1.8.3 乙醇洗脱液体积分数的考察

分别采用30%、50%、70%、95%的乙醇洗脱，对流出液进行检测后，精选出最佳乙醇洗脱液的体积分数。

1.8.4 洗脱体积的考察

按照从上述实验得到的最优上样条件上样，每10 mL 收集一管洗脱液，检测后，精选出最佳乙醇洗脱体积。

2 结果与分析

2.1 树脂筛选

AB-8、D101、X-5、NKA-9、NKA-Ⅱ5 种大孔树脂对藏药绿萝花中银锻苷的吸附率、解吸率及解吸量如表1 所示，结果表明5 种大孔吸附树脂对银椴苷的吸附率均较高，吸附能力很强，其中AB-8 树脂的吸附效果最好。故优选AB-8 型吸附树脂作为最佳吸附树脂。

表1 不同树脂静态吸附与解吸能力比较

2.2 上样浓度对吸附效果的影响

由图1 可知，随着藏药绿萝花的上样浓度逐渐增大，银椴苷的吸附量也在增加。在上样质量浓度达到2 mg/mL 时，吸附量的增加开始趋于平缓。因此选择最佳上样液的质量浓度为2 mg/mL。

图1 上样浓度对吸附效果的影响

2.3 吸附泄漏曲线

图2 显示，当上样体积达到30 mL 时开始发生泄漏，130 mL 后银椴苷的质量浓度接近2 mg/mL，可知树脂柱已达到饱和状态。当上样体积达到60 mL 时，流出液中银椴苷的质量浓度接近原上样液的20%。由此确定最佳上样体积为60 mL。

图2 吸附泄露曲线

2.4 乙醇洗脱液体积分数对解吸效果的影响

由图3 可知，随着乙醇洗脱液体积分数的增大，其解吸效果也在相应地提高。但当乙醇体积分数大于70%时，银椴苷解吸率提高得较为缓慢，同时洗脱液中溶于乙醇的杂质也在增加，致使银椴苷的纯度下降。因此，选择70%的乙醇作为洗脱剂。

图3 乙醇洗脱液体积分数对解吸效果的影响

2.5 乙醇洗脱体积对洗脱效果的影响

由图4 可知，当乙醇洗脱剂体积为20 mL 时，洗脱下来的银椴苷的浓度达到最高，当乙醇洗脱剂的体积达到40～50 mL 时，银椴苷的浓度波动不大，开始趋于平缓，故确定最佳的乙醇洗脱体积为50 mL。

图4 乙醇洗脱体积对解吸效果的影响

3 结论

本研究通过实验发现AB-8 型树脂对银椴苷的吸附率最高、解吸量最大。确定上样液质量浓度为2 mg/mL、上样液体积为60 mL、洗脱液体积分数为70%、洗脱体积为50 mL 作为最佳上样及洗脱条件。该研究为银椴苷的富集纯化提供了可靠的依据，也为藏药绿萝花的进一步开发利用提供了一定的理论参考。