脑出血的分子机制与治疗药物开发*

周悦,李相军

(吉林大学药学院实验药理与毒理学教研室,长春 130021)

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)指原发性非外伤性脑实质出血,其特征是脑实质出血和由于对血液成分的强烈神经炎症反应导致的继发性脑损伤,前者主要指血肿的占位效应及其对脑组织的压迫,而后者主要指脑实质内的血液以及溶血产物释放的有害物质所致脑损伤[1]。脑出血的治疗手段主要包括手术治疗和药物治疗。目前用于脑出血药物治疗的主要有止血类药物、降低颅内压的药物、及改善脑循环的药物,但药物的疗效并不理想,临床上仍缺乏有效的治疗药物。随着对脑出血发生机制认识的不断深入,保护神经元、抑制或减少受累脑组织炎症反应及免疫损伤、减少水肿及清除血肿成为脑出血防治药物研发热点。笔者对近年发现的参与脑出血进程的分子机制进行综述,试图为相关药物研发提供线索,促进脑出血治疗药物研发。

1 减少神经细胞损伤

血肿对脑组织的压迫及其所含的有害物质均可引发神经细胞损伤,使神经功能恶化。近年发现,神经细胞凋亡也是神经功能损伤的重要原因[2],通过多种途径抑制神经细胞受损进程,减少神经细胞的死亡数量,保护神经功能,可能是脑出血治疗一个方向。

1.1脑表达的X连锁基因1(brain-expressed X-linked 1,Bex1 ) Bex1基因在中枢神经系统神经元中高度表达,常在细胞内信号通路中充当接头或调节剂,Bex1具有抗凋亡作用。研究发现,Bex1蛋白水平在大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞中呈细胞周期依赖性,在G1期表达水平最低,在S期表达水平最高,证明其表达下调对于神经细胞的细胞周期退出十分必要。何明清等[3]在ICH大鼠中发现,血肿附近神经元中Bex1的表达明显上调,活性半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(caspase-3)和Bax的表达增加,且二者均呈时间依赖性。用Bex1 siRNA抑制PC12细胞中Bex1表达,发现活性caspase-3及Bax表达明显增加。这些证据表明,Bex1的表达可能对ICH后的神经元起抗凋亡作用,提示上调Bex1基因的表达水平的药物在ICH后治疗中可能有益。但目前以Bex1为靶点的研究仅限于基因水平,例如免疫组化、生物信息学分析等,而Bex1特异性作用物质尚不明确,有待进一步探讨。

1.2黑皮质素受体4(melanocortin receptor 4,MC4R)-AMP依赖的蛋白激酶信号通路(MC4R-AMPK) MC4R是一种G蛋白偶联受体,具有7个跨膜结构域和1个无内含子基因,具有4个潜在的糖基化位点和2个潜在的棕榈酰化位点。MC4R 主要在中枢神经系统中表达,包括丘脑、下丘脑、皮质、海马和脑干。

CHEN等[4]用选择性MC4R激动剂RO27-3225激活ICH小鼠中小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞表面的MC4R,发现其可增加血肿周围区域AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的表达,后者的激活可抑制促炎因子c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)的表达,减少肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-1β等促炎物质的释放,抑制神经炎症反应。RO27-3225还可通过激活MC4R抑制凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1,ASK1)/JNK/p38 MAPK信号通路活性,减少ICH后神经元中NLRP1炎性体的激活,阻止神经元细胞的凋亡路径,改善神经功能[5]。这些研究结果提示,MC4R可作为脑出血治疗靶点,其激动剂可能对减轻ICH后神经元损伤、保护神经元功能有益。RO27-3225是目前发现的一种最有效的选择性MC4R激动剂,受到广泛重视,相信随着研究不断深入,将会为脑出血的治疗带来突破。

1.3PI3K-Akt/PTEN-Akt信号通路 Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,在促进细胞存活中起关键作用。Akt可激活或抑制下游信号,包括Bcl-2关联死亡启动子重组蛋白(Bad)、caspase-9 和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)发挥促进细胞存活和生长的作用,Akt的持续激活有利于阻止脑出血后神经细胞凋亡。目前发现,PI3K可直接激活Akt,而10号染色体上缺失的同源磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)为PIP3磷酸酶,可将PIP3转变为PIP2,进而抑制PI3K/Akt通路,拮抗Akt依赖性细胞存活,诱发神经细胞凋亡。研究表明,口服香叶基丙酮和脑室内注射甘氨酸对自体血注入ICH模型大鼠均有明显的神经保护作用,其机制均与Akt激活有关,但二者激活Akt方式不同。口服香叶基丙酮通过提高PI3K表达激活Akt,而脑室内注射甘氨酸则是通过抑制PTEN的表达和活性增加Akt磷酸化水平[6-7]。可见,Akt的激活对拮抗神经元凋亡,减轻神经组织损伤,恢复其功能有重要意义,可能是治疗脑出血的一个重要靶点。

目前,关于Akt的药物研发取得较大进展,主要可分为中医中药开发与合成药物开发两大类。已被证明可以通过Akt通路治疗脑出血的中药有忍冬苷、生大黄、补阳还五汤等[8-10],同时被证明可通过Akt通路对脑出血起治疗作用的化学药物有丁苯酚[11]、依达拉奉联合黄体酮[12]等。

1.4A20-MLKL信号通路 A20是一种去泛素化酶,被广泛认为是一种与多种人类脑自身免疫性疾病、神经退行性疾病和脑肿瘤以及卒中有关的抗炎蛋白。研究表明,ICH后受损神经元受体相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1,RIP1)的表达显著增加,并与受损神经元RIP3组成坏死性凋亡的特征复合物,激活混合谱系激酶结构域样假激酶(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL),导致质膜的完整性破坏,引起细胞凋亡。A20对RIP3依赖的坏死性凋亡有明显抑制作用,激活后可明显减少ICH后神经细胞的凋亡,改善神经元功能。陆佳楠[13]研究显示,褪黑素治疗后,C57小鼠ICH后血肿周围小胶质细胞中A20蛋白表达被显著上调,神经细胞凋亡明显减少。体外应用A20 siRNA抑制A20转录后,褪黑素抑制神经细胞坏死性凋亡作用消失,表明褪黑素抑制ICH后的细胞凋亡,保护神经元作用是通过调节A20表达实现的[14],提示去泛素化酶A20也可能是ICH治疗靶点,其激活剂可能对ICH治疗有利。

目前研究发现脂联素可以通过A20抑制脂多糖诱导的小胶质细胞炎症反应,伊马替尼可以通过上调A20抑制T细胞中的NF-κB通路,甲状腺素可作用胰岛β细胞上调A20 mRNA的表达,上述药物可作用于A20,但其在脑出血治疗中的探究仍需进一步探索。

1.5Miro1与GDF11 Miro1是将线粒体连接到运动蛋白的纽带,它在神经元中辅助蛋白的作用下可以帮助线粒体沿着细胞内微管移动,其表达增加可促进体外受损神经元的线粒体运输和分布。LI等[15]用自体血注入法复制大鼠基底神经节ICH模型时发现,ICH后大脑Miro1蛋白水平显著增加,而敲除Miro1后,ICH后大鼠的脑损伤加重,表明ICH后脑组织损伤与线粒体转运和分布有关。目前实验中发现对Miro1有作用的药物较少,仅发现匹罗卡品可诱导大鼠颞叶中Miro1表达的改变[16]。

生长分化因子11(growth and diferentiation factor 11,GDF11) 是转化生长因子(TGF)-β超家族的成员,可以影响线粒体钙离子(Ca2+)稳态、氧自由基(ROS)积累和线粒体去极化,减少神经炎症反应,表明GDF11具有神经保护机制的调节潜力。XIAO等[17]发现,GDF11可通过抑制线粒体ROS产生和线粒体动态改变之间的反馈回路来保护ICH后继发性损伤,导致线粒体功能减弱,从而减少细胞凋亡,并改善神经损伤。研究发现硫化氢可通过上调GDF11改善慢性应激大鼠海马细胞的焦亡作用,亚精胺可以上调GDF11拮抗高糖诱导的HT22细胞内质网应激反应,提示这两种药物作用于GDF11,并可在脑出血领域进行新一步探索。

1.6前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2-EP2)信号通路 PGE2受体是一种G蛋白偶联受体,作为高效的生物信使,通过诱导腺苷酸环化酶活性增加细胞内cAMP水平,进而参与蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)和环腺苷酸结合蛋白(Epac)的激活。据报道,前列腺素在中枢神经系统中经常具有相互矛盾的生理功能,PGE2-EP2-cAMP介导的PKA和Epac激活通常分别与神经保护和神经毒性作用相关。LECLERC等[18]发现,EP2受体的缺失可减少ICH后三价铁蓄积、神经炎症、血脑屏障的破坏和外周中性粒细胞浸润,促进ICH后功能恢复,表明PGE2-EP2轴与调节ICH后脑损伤、炎症和功能恢复密切相关。WU等[19]通过胶原酶诱导的ICH模型证实,PGE2受体激动剂米索前列醇可降低细胞炎症反应,减少ICH之后的脑损伤体积、水肿和脑萎缩,减轻氧化性脑损伤。总之,PGE2在脑出血进程中作用及机制尚不清楚,PGE2受体干预剂能否成为ICH治疗的有效药物仍需进一步探究。

2 抑制炎症反应

脑出血时的炎症反应主要由脑实质内的血液触发,小胶质细胞和星形胶质细胞是第一反应者。脑出血后,有害成分作用于炎症反应通路,引发神经炎症,加重脑水肿,使神经功能恶化,病死率增加。故抑制炎症反应通路,在ICH治疗中具有重要意义。

2.1核因子E2相关因子2(Nrf2)-抗氧化反应元件(anti-oxidant response element,ARE)信号通路 Nrf2是一种主要的Ⅱ相基因调节因子,是一种广泛表达的转录因子,可与ARE共存并调节Ⅱ相解毒酶的表达。研究表明[20],Nrf2-ARE信号通路激活可促进其下游血红素加氧酶(HO-1)的表达,后者可抑制NF-κB及下游炎症因子的表达,抑制ICH后炎症反应的发生。WEI等[21]通过实验证明,烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)可激活Nrf2/HO-1信号通路,抑制ICH小鼠神经炎症以及氧化应激、神经细胞凋亡。INIAGHE等[22]发现食品防霉剂富二甲酯在小鼠ICH后可激活酪蛋白激酶2和Nrf2信号通路,进而发挥改善炎症、降低血脑屏障通透性并改善神经系统等功能。SHI等[23]发现富马酸单甲酯作为一种工业中间体,可激活microRNA-139/Nrf2轴,发挥抑制氧化应激和炎症反应的功能。这些研究成果显示,Nrf2-ARE-HO-1通路的激活剂可能在ICH治疗中有积极意义。NMN、富二甲酯以及富马酸单甲酯具有发展成为脑出血治疗药物的潜能。

2.2Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)4-NF-κB相关通路 TLR是一个病原体识别受体家族,可识别保守的微生物序列,其中TLR4是受体家族的重要成员,功能与炎症反应密切相关。脑出血后红细胞溶解,释放游离血红素。血肿成分即血红素可激活小胶质细胞上表达的TLR4,并通过TLR4下游MyD88/TRIF信号通路实现转录因子NF-κB的激活,调节炎症递质基因表达,最终导致脑出血炎症损伤加重。LAI等[24]发现,苯乙醇苷类抗氧化剂毛蕊花苷作为多种药用植物的活性成分,可阻断激活的小胶质细胞TLR4促炎通路,降低促炎因子如 NF-κB、IL-1β的水平。茶黄素具有多种生物学功能,如抗诱变性、自由基清除、抗癌、抗病毒、降血脂以及抗炎活性。FU等[25]用Ⅶ型胶原酶诱导ICH大鼠模型,通过管饲法进行不同剂量茶黄素预处理,结果分析发现,NF-κB-p65、IL-1β和caspase-1的mRNA水平在ICH发作后明显上调,但在茶黄素预处理后下调。表明茶黄素作为一种抗炎因子,可通过抑制NF-κB相关通路抑制氧化应激和炎症反应,减轻ICH引起的大鼠炎症反应和脑损伤。

综上所述,抑制TLR4-NF-κB相关通路可抑制氧化应激和炎症反应,减轻ICH引起的大鼠炎症反应和脑损伤。毛蕊花苷与茶黄素均可作用于TLR4-NF-κB相关通路,发挥治疗脑出血的作用,具有开发为脑出血治疗药物的可能性。

2.3核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)-IL-1β/IL-18信号通路 NLRP3炎性体是一种IL-1β家族细胞因子激活蛋白复合物,其激活与各种神经病理学中的炎症反应有关。一旦被激活,NLRP3会调节caspase-1介导的IL-1β和IL-18的成熟,从而导致炎症细胞的后续聚集。因此,使用针对NLRP3的治疗剂进行干预可能会减少ICH损伤的严重程度。

研究表明,水飞蓟素可通过下调NLRP3、caspase-1和IL-1β表达来防止炎症反应[26]。小剂量非马沙坦作为选择性AT1受体阻滞剂低剂量预处理可通过降低NLRP3/ASC/caspase-1和NF-κB通路的激活保护急性ICH的继发性损伤[27]。第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素——虫草素也可通过下调NLRP3炎性体成分的表达以及减少炎性体底物IL-1β和 IL-18的产生和释放发挥抗炎作用[28]。提示NLRP3抑制剂在治疗ICH方面可能具有广阔前景。水飞蓟素、小剂量非马沙坦、虫草素抑制NLRP3相关通路,发挥治疗脑出血的作用,可以为脑出血治疗药物的开发提供参照。

2.4IL-17A与IL-33 小胶质细胞激活是ICH中神经炎症的重要因素。YU等[29]研究发现,IL-17A可加重ICH 诱导的小胶质细胞活化和神经炎症,而IL-17A Abs 可以降低ICH诱导的TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平,并且其下游的信号因子MyD88、TRIF、IκBα和NF-κBp65的水平被显著抑制,表明IL-17A Abs可以抑制ICH诱导的神经炎症,为治疗ICH提供新的可能。

IL-33是最近发现的IL-1家族成员,它通过与IL-1受体相关蛋白ST2 和IL-1RAcP 组成的异二聚体结合发挥生物学功能。IL-33诱导的信号转导的结果是将IRAK、IRAK4、MyD88和TRAF6募集到ST2,最终导致 NF-κB激活。GAO等[30]研究发现,IL-33脑室内注射可减轻脑含水量,减少凋亡细胞的数量,改善ICH后的神经功能,其机制可与IL-33抑制促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达有关。

2.5Nurr1(NR4A2) Nurr1是主要在中枢神经系统中表达的核受体家族的成员,这种核受体可以作为大脑炎症反应的调节剂。阿莫地喹是一种4-氨基喹啉类抗疟疾药物,被证明对 Nurr1 具有激动活性。研究发现[31],向胶原酶诱导ICH小鼠的腹腔中注射Nurr1激动剂阿莫地喹,可以显著抑制血肿周围区域活化小胶质细胞的积累。同时,阿莫地喹也显著抑制IL-1β、趋化因子CXCL2和CCL2mRNA的表达水平,减轻与神经胶质细胞活化相关的炎症反应,而且还能改善 ICH 后的神经系统预后。在此基础上,研究发现龟羚帕安丸可以上调帕金森病大鼠中脑黑质Nurr1的表达[32],海洛因可以上调大鼠中脑腹侧被盖区中Nurr1蛋白表达[33]。这两种药物作用机制的发现为脑出血疾病的治疗提供新的线索。

3 减少免疫损伤

ICH引起强烈的骨髓(单核细胞和中性粒细胞浸润以及小胶质细胞)和淋巴(T细胞)免疫反应,从外周免疫系统侵入血管神经单元的炎症细胞是继发性损伤的一个主要驱动因素。研究表明,免疫反应存在于脑出血后继发性脑损伤的各种病理生理过程,二者具有密切的联系,如神经炎症、脑水肿以及神经元损伤中均贯穿着免疫反应,免疫损伤与脑出血后的损伤密切相关[34]。

T淋巴细胞是特异性免疫系统中的关键细胞,在细胞介导的免疫反应中起关键作用。T 细胞活化过程需要由B7-1(CD80)/B7-2 (CD86) 结合同源受体 CD28/CTLA-4 来提供二级信号传导,进一步传递阳性信号。研究发现,ICH小鼠内眦注射抗B7-1抗体后,T细胞和B细胞的增殖率均降低,促炎细胞因子IFN-γ和抗炎细胞因子IL-4比例失衡被逆转,而ICH小鼠学习记忆能力明显提升,表明阻断B7-1/CD28信号通路有助于促进空间记忆恢复,改善ICH 结局[35]。目前有研究发现,蒙药森登-4可通过下调CTLA-4/B7-1的表达降低CIA大鼠炎性反应[36],参地颗粒联合黄葵胶囊治疗可降低慢性肾小球肾炎患者体内B7-1水平[37],因此可以进行这两种药物在脑出血模型中的研究,促进脑出血治疗药物开发。

4 减轻水肿与清除血肿

颅内压力升高使脑组织缺血、缺氧,造成神经细胞功能不可逆的损伤,进而造成脑出血的二次伤害。颅内压的变化是导致脑出血不良后果的重要原因之一,影响颅内压变化的主要因素是血肿周围的水肿和产生的血肿量。水肿的产生原因很多,如血管源性因素、凝血级联反应及凝血酶生成、炎症反应、红细胞溶解和补体攻击等。其中最常见的是血管源性水肿,由脑出血后静脉压力升高引起,促进紧密连接蛋白的分解从而破坏血脑屏障,导致渗出液及细胞外液进入脑实质,造成脑水肿。研究表明,许多因子能够改善血脑屏障通透性,且血块的形成对血肿周围脑水肿的产生及进展具有重要作用。

4.1大麻素受体2(Cannabinoid receptor 2,CB2R)-MKP-1信号通路 研究发现,CB2R激动剂JWH-133可显著下调TGF-β1水平,减少侧脑室容积,改善相关的神经功能缺损,抑制神经炎症和减少血脑屏障损伤,其机制可能与CB2R激活后上调丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase1,MKP-1)信号通路,进而抑制ICH诱导的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)过度激活有关[38-39]。目前有研究证明可以激动CB2R的药物有芍药苷、石甘散联合托吡酯等。随着化学合成的发展,有实验研究发现哒嗪-3-甲酰胺类化合物对CB2R有选择性激动作用,这为CB2R激动剂的合成带来新的突破,也极大促进脑出血药物开发利用。

4.2过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferators-activated receptorsγ,PPAR-γ)-Hp-Hb-CD163信号通路 PPAR-γ 是一种转录因子,可以调节过氧化氢酶和超氧化物歧化酶这两种重要的抗氧化基因的表达,与促进血肿清除和减少脑出血后的神经功能障碍有关。WANG等[40]发现,PPAR-γ激动剂红霉素可显著上调ICH小鼠PPAR-γ、触珠蛋白(Hp)和 CD163 的表达水平,其机制与PPAR-γ激活Hp-Hb-CD163途径,进而保护 Hb 免受氧化修饰,形成Hp-Hb-CD163复合体系,介导血红蛋白的内吞作用,促进Hb清除有关。辛伐他汀也可激活PPAR-γ、上调CD36而增强血肿清除和减轻神经功能缺损[41-42]。上述结论表明,PPAR-γ激动剂红霉素、辛伐他汀作为脑出血治疗药物具有进一步开发的潜能。

5 总结与展望

脑出血机制复杂,症状重,愈后差,致残率和致死率均较高。外科手术的发展为脑出血患者带来福音,但继发性脑损伤却仍可通过多种机制发生,导致患者预后仍不理想,因而需要外科治疗与药物治疗相互补充,共同改善脑出血的治疗效果。药物治疗主要目的是减少神经细胞损伤,抑制炎症反应,减少免疫损伤及抑制脑水肿和血肿,因而笔者针对这4个方面的机制进行阐述。笔者在本文对参与脑出血发生发展的主要因子及信号通路进行综述,可为治疗脑出血药物研发提供线索。