miR-34a、sirt1 与急性缺血性脑卒中患者侧支循环及预后的关系

曾友才 唐绍军

急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS）是一种突发性疾病，多发于老年人，指脑部血液发生中断而引起的脑组织坏死，该疾病具有发病率高、致死率高的特点[1]。脑侧支循环是指当脑部血管发生堵塞时，侧边潜在的血管开通或生成，从而达到血液代偿的作用，具有提高脑血管再通概率，并减少出血转化、改善预后的重要作用[2]。AIS 的具体发病机制尚未明晰，但有研究显示，颈动脉粥样硬化参与AIS 的进程[3]。而颈动脉粥样硬化斑块的形成及其稳定性与血清miR-34a、sirt1 水平异常关系密切[4]。miR-34a 参与血管内皮损伤过程，在心脑血管疾病中具有重要作用[5]。沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，sirt1）作为miR-34a 的靶基因之一，具有保护细胞、抗凋亡、减缓炎症的作用，参与疾病的进展程度[6]。本研究主要通过检测miR-34a、sirt1 的表达水平，旨在探究二者与AIS 患者侧支循环及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017 年2 月至2020 年2 月浙江省义乌復元医院神经内科收治的87 例AIS 患者为研究对象。根据侧支循环评估结果将其分为侧支循环不良组（36 例）和侧支循环良好组（51 例）。选取同期健康体检者为对照组（60 例）。本研究经本院伦理委员会批准[伦审（2017）第05 号]。所有研究对象均知情同意。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：（1）临床确诊为AIS[7]；（2）首次病发AIS；（3）年龄≥18 岁；（4）从发病到进行数字减影血管造影检查不超过7 d。排除标准：（1）患有肝肾心严重疾病患者；（2）妊娠期女性；（3）患有恶性肿瘤及感染性疾病者；（4）不积极配合治疗者。

1.3 主要试剂及仪器 离心机购自贝克曼库尔特国际贸易（上海）有限公司（型号Avanti JXN-30）；超低温冷藏箱购自山东博科（型号BDF-86V348）；Trizol试剂购自于齐一生物科技（上海）有限公司（批号ml095476）；RNA 逆转录试剂盒（批号4366596）、qRT-PCR 试剂盒（批号11791200）、qRT-PCR 仪均购自于赛默飞世尔科技（中国）有限公司（型号Pikoreal）；生工生物工程（上海）股份有限公司进行引物合成，引物序列：miR-34a 正向：5'-TCTGTCTCTCTTGGCAGTGTCTT-3'，反向5'-AATGGTTGTTCTCCACTCTCTCTC-3'；U6 正向：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；反向5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；sirt1 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司（批号ml038429）。

1.4 观察指标 收集入组者临床资料，包括性别、年龄、体质指数、入院时美国国立卫生研究院卒中量表（the National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）评分[8]、梗死体积。

1.5 方 法

1.5.1 样品采集 采集所有受试者空腹静脉血3～5 mL，离心（3000 r/min，10 min）取上清液后，储存于-80 ℃。

1.5.2 DSA 检查及侧支循环评估 在右侧股动脉处进行穿刺（改良的Seldinger 穿刺技术），放入5F 动脉鞘。在主动脉弓处置入5F 的Pigtail 导管，进行造影。双侧颈总动脉、双侧椎动脉处、双侧锁骨下动脉、颈内动脉在更换5F 椎动脉造影管后进行DSA 检查。采用ASITN/SIR 血流分级系统对其侧支循环进行评估[9]，分为侧支循环不良组（0～1 级）和侧支循环良好组（2～4 级）。

1.5.3 qRT-PCR 法检测血清miR-34a 表达水平采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测血清miR-34a 水平。在各血清样品中加入Trizol 试剂进行总RNA 的提取，并检测其纯度。严格按照RNA 逆转录试剂盒试验步骤将RNA 反转录为cDNA。qRT-PCR扩增反应条件为：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s，共计40 个循环，其中以U6 为对照。采用2-ΔΔCT法计算miR-34a 的相对表达水平。

1.5.4 ELISA 法检测血清sirt1 表达水平 采用特定的ELISA 试剂盒检测血清中sirt1 水平，其具体操作步骤严格遵守试剂盒说明书。

1.6 随 访 对AIS 患者进3 个月的随访评估其神经功能恢复状态，采用改良Rankin 量表评分[10]，当分数≤2 分时表示预后良好，＞2 分时则表示预后不良。

1.7 统计学方法 应用SPSS 23.0 软件分析数据，计量资料均符合正态分布，用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用配对样本t 检验；计数资料用百分比表示，采用χ2检验。miR-34a、sirt1 水平对AIS 患者预后的诊断价值通过受试者工作特征曲线（ROC）进行分析。AIS 患者发生不良预后的危险因素通过多因素Logistic 进行分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组研究对象一般临床资料比较 对照组、侧支循环不良组、侧支循环良好组之间的年龄、性别、体质指数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），侧支循环不良组患者入院时NIHSS 评分、梗死体积较侧支循环良好组较高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组研究对象一般临床资料比较

2.2 各组研究对象血清miR-34a、sirt1 表达水平比较 miR-34a 水平在侧支循环不良组、侧支循环良好组中显著高于对照组，而且侧支循环不良组较侧支循环良好组miR-34a 水平升高（P＜0.05）；sirt1 水平侧支循环不良组、侧支循环良好组中显著低于对照组，而且侧支循环不良组较侧支循环良好组水平下降（P＜0.05）。见表2。

表2 各组研究对象血清miR-34a、sirt1 表达水平比较（±s）

表2 各组研究对象血清miR-34a、sirt1 表达水平比较（±s）

注：sirt1 为沉默信息调节因子1；与对照组比较，aP＜0.05；与侧支循环良好组比较，bP＜0.05

组别对照组侧支循环良好组侧支循环不良组F 值P 值例数60 51 36 miR-34a/U6 1.02±0.28 1.69±0.51a 2.46±0.67ab 101.966<0.001 sirt1（μg/L）2.16±0.54 1.06±0.27a 0.64±0.16ab 203.098<0.001

2.3 AIS 预后良好与预后不良患者miR-34a、sirt1水平及相关指标比较 预后良好组73 例，预后不良组14 例。与预后良好组相比，预后不良组AIS 患者血清miR-34a 水平、入院时NIHSS 评分、梗死体积较高（P＜0.05），而sirt1 水平较低（P＜0.05）。见表3。

表3 AIS 预后良好与预后不良患者miR-34a、sirt1 水平及相关指标比较（±s）

表3 AIS 预后良好与预后不良患者miR-34a、sirt1 水平及相关指标比较（±s）

注：sirt1 为沉默信息调节因子1；NIHSS 为美国国立卫生研究院卒中量表

组别预后良好组预后不良组t 值P 值例数73 14 miR-34a/U6 1.86±0.55 2.78±0.71 5.462<0.001 sirt1（μg/L）0.94±0.24 0.61±0.14 4.970<0.001 NIHSS 评分（分）11.79±3.36 19.75±4.61 7.622<0.001梗死体积（cm3）6.13±2.34 10.57±3.32 6.051<0.001

2.4 ROC 曲线分析miR-34a、sirt1 水平对AIS 患者预后的诊断价值 miR-34a、sirt1 水平对AIS 患者预后不良的诊断AUC 分别为0.830、0.840，截断值分别为2.216，0.807 μg/L，敏感性分别为85.70%、92.90%，特异性分别为65.80%、69.90%。见表4，图1。

图1 miR-34a、sirt1 水平对AIS 患者预后诊断价值的ROC曲线

表4 ROC 曲线分析血清miR-34a、sirt1 水平对AIS 患者预后的诊断价值

2.5 AIS 患者不良预后多因素Logistic 分析 以NIHSS 评分、梗死体积、miR-34a 及sirt1 水平为自变量，以表3 中为P＜0.05 的指标因变量进行Logistic多因素分析，结果显示，梗死体积、miR-34a 水平是AIS 患者不良预后的独立危险因素，高水平sirt1 是其独立保护因素（P＜0.05）。见表5。

表5 AIS 患者不良预后多因素Logistic 分析

3 讨 论

AIS 是指脑部组织局部发生供血不足或者完全中断，而造成脑组织环死的疾病[10]。患者的缺血半暗带、梗死体积、病情严重程度及预后与侧支循环的形成有密切的关系[11]。目前脑血管造影是临床上评估侧支循环的有效标准，但是需要进行侵入操作，部分患者因某些原因并不能接受，因此寻找简单、快速有效的生物标志物对侧支循环的形成及AIS 患者的预后有重要的意义。

细胞增殖、分化是新血管生成的重要依据。miRNA 在转录后与靶基因结合发挥调控作用，在心脑血管疾病中扮演着重要角色。miR-34a 在脑、心等血管内皮生成、细胞凋亡中有重要作用[12]。赵茹等[13]研究表明，AIS 侧支循环不良组患者入院时大面积脑梗死例数、NIHSS 评分显著高于侧支循环良好组。在本研究中，与对照组相比，侧支循环良好组、侧支循环不良组患者血清miR-34a 明显上调，而且侧支循环不良组较侧支循环良好组miR-34a 水平、NIHSS评分、梗死体积较高，提示miR-34a 可能参与了AIS患者侧支循环的形成。

sirt1 是miR-34a 潜在的靶基因之一，是一种依赖NAD+的去乙酰化酶，具有保护细胞，抗炎症反应的作用[14]。鄢晓丽等[15]研究发现，与对照组相比，血清sirt1 水平在慢性心力衰竭患者中明显降低，且心功能分级越差，sirt1 水平越低。有研究证实，miR-34a通过靶向调节sirt1，能够保护细胞，从而减少细胞凋亡[16]。本研究发现，sirt1 水平侧支循环不良组、侧支循环良好组中显著低于对照组，而且侧支循环不良组较侧支循环良好组水平下降，其差异均有统计学意义，提示sirt1 参与了AIS 患者侧支循环的形成。

朱艳玲等[17]研究证实，脑梗死后认知功能障碍患者外周血miR-34a、sirt1 水平呈异常表达，并表明高水平miR-34a 是影响其发生的独立危险因素，高水平sirt1 是影响其发生的独立保护因素。本研究结果发现，与预后良好组相比，预后不良组AIS 患者血清miR-34a 水平较高，而sirt1 水平较低，提示miR-34a、sirt1 水平的异常表达可能与AIS 患者的不良预后有关。miR-34a、sirt1 水平诊断AIS 患者预后不良AUC 分别为0.830、0.840，敏感性分别为85.70%、92.90%，特异性分别为65.80%、69.90%，提示miR-34a、sirt1 对AIS 患者是否发生不良预后有较高的预测效能，且当miR-34a 水平大于2.216，sirt1 水平<0.807 μg/L 时，AIS 患者有发生不良预后的风险。

综上所述，AIS 患者miR-34a 水平升高，而sirt1水平下降，二者均对AIS 患者是否发生不良预后有较高的预测效能。但本研究仍存在一些问题，如样本量较少，患者的随访时间较短，需进一步深入研究miR-34a、sirt1 与AIS 复杂机制之间的关系。