冠心宁治疗急性心肌梗死后心力衰竭大鼠作用机制研究

廖 骏 沈玮芸 孙启银 柳元化

急性心肌梗死后心力衰竭具有心功能严重损伤，治疗难度大等特点，也是导致直接经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）患者住院病死的主要原因[1-2]。西医在治疗急性心肌梗死后心力衰竭时多通过扩血管、利尿、抑制血小板聚集等方式，其中氯吡格雷可抑制血小板聚集，对患者的临床症状具有一定的改善效果[3]。炎症及氧化应激会引发心肌细胞死亡及心力衰竭，而磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路也与心力衰竭的发展密切相关[4-5]。中医学认为，心力衰竭的病机与邪痹心络，气血不畅有关。冠心宁是一种中成药，具有活血化瘀、通脉养心的功效，且前期研究显示，冠心宁可促进心力衰竭患者氧自由基清除、抑制炎症反应，改善心功能，但关于其抗心力衰竭的具体机制仍存在一定争议[6-7]。本研究探讨冠心宁治疗急性心肌梗死后心力衰竭大鼠的作用机制，现报道如下。

1 实验材料

1.1 动 物 50 只SPF 级成年雄性SD 大鼠均来自河南省郑州市华兴实验动物养殖场，体质量180～220（200.46±15.74）g，动物生产许可证号SCXK（豫）2022-0021。均饲养于SPF 级动物房，研究符合实验动物福利伦理规定，且经伦理审查委员会批准，伦理号：YFY-DW20210039。造模前适应性饲养2 周，常规饲料饲养，自由饮水。

1.2 药品与试剂

1.2.1 药品 冠心宁（正大青春宝药业，规格0.38g/片，批号Z20190028）；氯吡格雷[赛诺菲（杭州）制药有限公司，规格75 mg，批号4A689]。

1.2.2 药品制备 冠心宁：将0.38g 片剂溶解于20mL超纯水中，即每毫升水中含0.019 g 冠心宁。氯吡格雷：将75 mg 氯吡格雷溶解于25 mL 超纯水中，即每毫升水中含3 mg 氯吡格雷，需要时现用现配。

1.2.3 试 剂 磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）抗体（abcam 公司，批号Ab86714）；蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗体（CST 公司，批号#9272）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒、细胞总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）检测试剂盒，ROS、T-AOC 检测试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司（批号20210507、20210704）；血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、转 化 生 长 因 子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）检测试剂盒均购自上海纪宁生物科技有限公司（批号20210408、20210715）。

1.3 仪 器 小动物简易呼吸机（美国Harvard Apparatus 公司，TKR-200C 型）；荧光酶标仪（美国Molecular Devices 公司，SpectraMax M3 型）；电泳仪（美国Bio-Rad 公司，PowerPac HC 型）；电转仪（美国Bio-Rad 公司，Gene Pulser MXcell 型）；灰度扫描仪（美国GE 公司，Image ScannerⅢ型）；离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司，Multifuge X1R）；PowerLab 型生理记录仪（上海然哲仪器设备有限公司）；激光共聚焦显微镜（德国Leica 公司，DMI 3006 型）。

2 实验方法

2.1 急性心肌梗死后心力衰竭造模 50 只SPF 级雄性SD 大鼠均采取结扎左冠状动脉前降支的方法进行造模。术前禁食禁饮12 h，采用腹腔注射50 mg/kg 2%戊巴比妥钠麻醉后仰卧位固定，常规消毒胸部皮肤行气管插管（连接小动物简易呼吸机），在左侧胸部做一斜切口（切口方向从右下至左上），钝性分离胸肌，第4 肋间切开肋间肌（沿下位肋骨上缘方向）进入胸腔，并对第4、5 肋间隙进行扩大、固定操作，之后采用镊子撕开心包，将心脏挤压至胸腔外，迅速对左冠状动脉前降支下2 mm 位置进行结扎，将心脏归位后观察心电图变化，无异常后，逐层缝合。造模成功判定：术后左室射血分数（left ventricular ejection fractions，LVEF）＜50%。

2.2 分组及给药剂量 50 只大鼠中45 只造模成功，5 只死亡，采用随机数字表法将45 只造模成功的大鼠分为空白对照组、氯吡格雷组及冠心宁组，每组各15 只。参照《动物实验方法学》[8]，按照动物公斤体质量剂量换算公式dB=DA×K（K 为人公斤体质量剂量换算系数，为6.25），设大鼠为B，人为A，计算出冠心宁d 大鼠=33.94 mg/kg；氯吡格雷d 大鼠=6.69 mg/kg。空白对照组：给予超纯水1.0 mL/kg 灌胃，每天1 次，连续喂养4 周。氯吡格雷组：依据上述换算的给药剂量及配药浓度，给予2.23 mL/d 氯吡格雷药液灌胃，连续喂养4 周。冠心宁组：每只给予1.78 mL/d 冠心宁药液灌胃，连续喂养4 周。

2.3 观察指标

2.3.1 心肌超微结构 取大鼠心肌组织，在4 ℃环境中，2.5%戊二醛固定24 h，1%锇酸固定1 h，包埋切片，取3 片铜网/个心肌组织，采用激光共聚焦显微镜观察。

2.3.2 心肌组织中PI3K、AKT 表达 取大鼠心肌组织，按150～250 μL 裂解液/20 mg 组织比例提取心肌组织蛋白并测量浓度，之后对80 μg 蛋白进行SDSPAGE 电泳、转膜操作，5%脱脂奶粉封闭处理，加入一抗P13K（1∶1000），AKT（1∶1000），在4 ℃环境中孵育过夜，加入二抗，37 ℃下孵育1 h，ECL 显色，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，采用灰度扫描仪分析蛋白条带灰度值。

2.3.3 心肌组织中氧化应激因子 ROS：取大鼠心肌组织缺血部位，剪碎并加入胰酶消化液，37℃下混合裂解、过滤，离心（1200 r/min，离心10 min）处理后取下层沉淀物，并应用无血清培养液制成1×105个/mL单细胞悬液。按照体积比1∶1000[27'-二氯荧光黄双乙酸盐（2'7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）：无血清培养液]，培养液稀释DCFH-DA探针，加入单细胞悬液使其最终浓度维持在10μmol/L，37 ℃下孵育20 min 后，采用荧光酶标仪在525 nm波长处测定细胞内的荧光值（fluorescence units，FU）。测量完毕，将组织置于4 ℃下裂解离心后（13000 r/min，离心15 min）取上清液。总蛋白含量采用BCA 法检测，ROS 水平为FU/蛋白含量。T-AOC：取大鼠心肌缺血区域组织，剪碎，按照100 μL 磷酸盐缓冲液/20 mg 组织比例放置在4 ℃环境中匀浆，并以12000 r/min，离心5 min 后取上清液备用。按2020 μL 标准液/个标准品孔、20 μL 上清液/个样品测试孔进行调配，室温孵育15 min 后，采用荧光酶标仪在515 nm 波长处测定光密度（optical density，OD）值，T-AOC 水平依据标准曲线计算。

2.3.4 血清TNF-α、TGF-β1 水平 按照标准品次序在酶标板内依次加入100 μL 的标准品溶液，空白孔内加入100 μL 待测样品，空白对照组加入100 μL PBS。各孔加入50 μL 酶标记溶液，将酶标板应用封闭膜密封后放置在37 ℃环境中孵育1 h，充分冲洗酶标板5 次，洗涤后将酶标板彻底拍干再在各孔中分别加入显色剂A、B 各50 μL，在37 ℃环境中避光反应15 min，各孔分别加50 μL 终止液终止反应，15 min 内采用酶标仪测定各孔吸光度得出血清TNF-α、TGF-β1 水平。

2.3.5 心脏彩超指数 将大鼠以仰卧位姿势固定在恒温加热板上，四肢固定在4 个金属极片上，充分暴露左前胸，将超声心动图探头放置在胸骨左缘，用2D 超声取左心室长轴切面，在M 型超声模式下测定左室室间隔收缩期厚度（IVSs）、左室室间隔舒张期厚度（IVSd）、左室短轴缩短率（LVFS）。

2.4 统计学方法 应用SPSS 25.0 软件进行统计分析，符合正态检验的连续变量采用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差进行多组间比较，采用LSD-t 检验进行组间两两比较，计数资料以例（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠心肌超微结构比较 激光共聚焦显微镜下显示，空白对照组心肌细胞肌源纤维排列紊乱，炎症细胞浸润等病理损伤严重。氯吡格雷组心肌细胞肌原纤维排列稍整齐，炎症细胞浸润等病理损伤稍减轻。冠心宁组肌原纤维排列整齐，炎症细胞浸润等病理损伤明显减轻。见图1。

图1 大鼠心肌超微结构

3.2 各组大鼠心肌组织PI3K、AKT 表达比较 氯吡格雷组、冠心宁组心肌组织PI3K、AKT 表达均高于空白对照组，且冠心宁组高于氯吡格雷组（P＜0.05）。见表1 和图2。

表1 三组大鼠心肌组织中PI3K、AKT 表达比较（±s）

表1 三组大鼠心肌组织中PI3K、AKT 表达比较（±s）

注：空白对照组给予超纯水灌胃；氯吡格雷组给予氯吡格雷药液灌胃；冠心宁组给予冠心宁药液灌胃；PI3K 为磷脂酰肌醇3-激酶；AKT为蛋白激酶B；与空白对照组比较，aP＜0.05；与氯吡格雷组比较，bP＜0.05

组别空白对照组氯吡格雷组冠心宁组鼠数15 15 15 PI3K 0.59±0.05 0.75±0.09a 0.84±0.11ab AKT 0.71±0.04 0.76±0.08a 0.91±0.13ab

图2 3 组大鼠心肌组织中P13K、AKT 蛋白的电泳条带注：空白对照组给予超纯水灌胃；氯吡格雷组给予氯吡格雷药液灌胃；冠心宁组给予冠心宁药液灌胃；PI3K 为磷脂酰肌醇3-激酶；AKT 为蛋白激酶B；GAPDH 为甘油醛-3-磷酸脱氢酶

3.3 各组大鼠心肌组织氧化应激因子水平比较 氯吡格雷组、冠心宁组心肌组织ROS 低于空白对照组，T-AOC 水平高于空白对照组，且冠心宁组心肌组织中ROS 低于氯吡格雷组，T-AOC 水平高于氯吡格雷组（P＜0.05）。见表2。

表2 三组大鼠心肌组织中氧化应激因子水平比较（±s）

表2 三组大鼠心肌组织中氧化应激因子水平比较（±s）

空白对照组给予超纯水灌胃；氯吡格雷组给予氯吡格雷药液灌胃；冠心宁组给予冠心宁药液灌胃；ROS 为活性氧；T-AOC 为细胞总抗氧化能力；与空白对照组比较，aP＜0.05；与氯吡格雷组比较，bP＜0.05

组别空白对照组氯吡格雷组冠心宁组鼠数15 15 15 ROS 39.71±2.46 28.58±2.27a 21.43±2.18ab T-AOC（mmol/mg）0.13±0.03 0.28±0.05a 0.35±0.09ab

3.4 各组大鼠血清TNF-α、TGF-β1 水平比较 氯吡格雷组、冠心宁组血清TNF-α 水平低于空白对照组，TGF-β1 水平高于空白对照组，且冠心宁组血清TNF-α 水平低于氯吡格雷组，TGF-β1 水平高于氯吡格雷组（P＜0.05）。见表3。

表3 三组大鼠血清TNF-α、TGF-β1 水平比较（ng/L，±s）

表3 三组大鼠血清TNF-α、TGF-β1 水平比较（ng/L，±s）

注：空白对照组给予超纯水灌胃；氯吡格雷组给予氯吡格雷药液灌胃；冠心宁组给予冠心宁药液灌胃；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；TGFβ1 为转化生长因子-β1；与空白对照组比较，aP＜0.05；与氯吡格雷组比较，bP＜0.05

组别空白对照组氯吡格雷组冠心宁组鼠数15 15 15 TNF-α 104.85±10.89 78.64±8.55a 68.85±6.76ab TGF-β1 1652.28±146.93 2176.39±174.39a 2314.71±179.58ab

3.5 各组大鼠心脏彩超指标比较 氯吡格雷组、冠心宁组IVSs 低于空白对照组，LVFS 高于空白对照组，且冠心宁组IVSs 低于氯吡格雷组，LVFS 高于氯吡格雷组（P＜0.05）。三组IVSd 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 三组大鼠心脏彩超指标比较（±s）

表4 三组大鼠心脏彩超指标比较（±s）

注：空白对照组给予超纯水灌胃；氯吡格雷组给予氯吡格雷药液灌胃；冠心宁组给予冠心宁药液灌胃；IVSs 为左室室间隔收缩期厚度；IVSd 为左室室间隔舒张期厚度；LVFS 为左室短轴缩短率；与空白对照组比较，aP＜0.05；与氯吡格雷组比较，bP＜0.05

组别空白对照组氯吡格雷组冠心宁组鼠数15 15 15 IVSs（mm）4.18±0.45 3.45±0.37a 2.74±0.31ab IVSd（mm）1.76±0.71 1.62±0.67 1.58±0.57 LVFS（%）35.71±2.52 40.81±2.61a 45.82±2.71ab

4 讨 论

急性心肌梗死后心肌组织处于严重的持续性心肌缺血、缺氧状态，致使心脏收缩及舒张功能障碍并引发心力衰竭[9]。传统干预方法虽能在一定程度上控制或减轻急性心肌梗死后心力衰竭患者的临床症状，但其病死率仍居高不下。随着中医药的发展与应用，基于传统中医药理论指导下的中药制剂在心血管疾病防治方面也逐渐引起重视，其具有多靶点效应，可通过多种途径来发挥治疗作用。

中医认为，心力衰竭属于“心悸”“心痹”“水肿”等范畴，其病机与心失所养、邪痹心络、气血不畅等有关，通过活血祛瘀、养心通络改善患者临床症状[10]。冠心宁中含丹参、川芎，其中丹参具有活血祛瘀、清心等作用，川芎可止痛行气、活血、祛风，共奏活血化瘀，通脉养心之效。

通过对大鼠的心肌微结构观察发现，与空白对照组、氯吡格雷组比较，冠心宁组大鼠的肌原纤维排列整齐，炎症细胞浸润等心肌损伤明显减轻。说明冠心宁可有效改善大鼠心肌组织的病理损伤，丹参中的丹参酮ⅡA 磺酸钠可通过抑制细胞凋亡和诱导自噬来保护缺血缺氧的心肌细胞并改善心功能，且丹参酮ⅡA 可诱导Beclinl 依赖自噬来抑制心肌细胞凋亡，进而减轻心肌损伤及因缺血缺氧所致的心肌组织病理损伤程度[11]。研究表明，川芎可通过调节持续的血管生成来减轻心肌组织损伤程度[12]。因为新生血管不足是心肌供血不足的特点之一，川芎可通过调节一氧化氮（NO）水平来促进血管内皮生长因子及其受体释放，进而促进新生血管形成并改善心肌细胞缺氧、缺血情况，抑制心肌细胞凋亡[13]。

研究证实，PI3K/AKT 信号通路在心肌细胞生长、修复过程中均发挥着重要作用[14]。本研究中与空白对照组、氯吡格雷组比较，冠心宁组心肌组织中PI3K、AKT 表达显著升高，说明冠心宁可促进造模大鼠心肌组织中P13K、ATK 蛋白表达，这是因为丹参中的丹参酮ⅡA 可调控P13K/AKT 信号来参与心肌细胞能量代谢的调控[15]。此外，与空白对照组、氯吡格雷组比较，冠心宁组心肌组织中ROS 显著降低，TAOC 水平显著升高，说明冠心宁可有效减轻急性心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌组织中的氧化应激反应。通过增强Beclinl 依赖自噬能力，调节NO 水平来减轻线粒体损伤程度进而提高心肌组织的抗氧化能力，缓解心肌细胞的过氧化损伤达到减轻心肌组织氧化应激反应的目的[16]。相较空白对照组、氯吡格雷组，冠心宁组血清TNF-α 水平显著降低、TGF-β1 水平显著升高，说明冠心宁可有效抑制造模大鼠炎症反应。冠心宁抑制多种致炎因子表达及细胞凋亡，增强自噬作用又抑制氧化应激反应，进而发挥抗炎作用。

此外，通过超声心动图发现冠心宁组IVSs 低于氯吡格雷组、空白对照组，LVFS 高于氯吡格雷组、空白对照组，说明冠心宁可有效改善造模大鼠的心功能。它可通过调控PI3K/ATK 信号通路及诱导Beclinl依赖自噬来发挥抑制氧化应激、抗炎等作用，对减轻心肌组织缺氧与缺血性损伤、抑制心肌细胞凋亡均有重要作用，这也是心功能改善的病理基础。

综上所述，冠心宁可改善急性心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌超微结构与心功能，降低氧化应激水平及炎症反应，其作用机制可能与激活PI3K/AKT 信号通路、增强线粒体功能有关。