UPLC-MS/MS法同时测定静灵口服液中8种有效成分的含量

静灵口服液是由辽宁东方人药业有限公司生产的1种纯中药制剂,收录于中华人民共和国卫生部药品标准中新药转正标准第4册WS3-43(Z-24)-93(Z)。该制剂由熟地黄、山药、女贞子、龙骨、茯苓、牡丹皮、黄柏、知母(盐)、泽泻、远志、五味子、石菖蒲12种中药制成,具有滋阴潜阳、宁神益智的功效,临床常用于儿童多动症及抽动症的治疗,疗效显著,安全性高[1-4]。最新研究表明,静灵口服液还具有排铅、抗氧化损伤的作用,在抗衰老方面有广阔的开发前景[5]。

近年来,中药质量标准逐步从单一活性成分向多个活性成分定性和定量测定的方向发展[6],静灵口服液作为复方药物,化学成分复杂,其中女贞子中的特女贞苷、黄柏中的小檗碱、远志中的远志口山酮Ⅲ、五味子中的五味子醇甲等均为其活性成分,具有抗炎、神经保护、抗抑郁、催眠镇静等作用[7-10]。目前现行标准中仅对黄柏中盐酸小檗碱含量进行测定,现有文献报道也只是采用高效液相色谱法测定盐酸小檗碱的含量,但其分析时间较长,选择性和灵敏度较低,且对于静灵口服液中紫外末端吸收、无紫外吸收、痕量物质的测定具有局限性,难以全面有效的控制药品质量[11-12]。本研究采用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS),建立了同时检测静灵口服液中盐酸小檗碱、远志口山酮Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖、盐酸黄柏碱、芒果苷、细叶远志皂苷、五味子醇甲、特女贞苷8个指标性成分含量的新方法,与高效液相色谱法相比具有灵敏度高、专属性强、分析时间短等优点[13-16],以期为进一步完善静灵口服液的质量标准提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters超高效液相色谱/三重四极杆串联质谱联用仪(Xevo TQ-S),配有电喷雾离子源(ESI),色谱工作站为Masslynx V 4.2。色谱柱为BEH C18(2.1×50 mm,1.7 μm);梅特勒电子天平(十万分之一)。

1.2 试药 对照品盐酸小檗碱(批号110713-202015,纯度85.9%)购自中国食品药品检定研究院;远志口山酮Ⅲ(批号PS012968,纯度97.4%)、3,6′-二芥子酰基蔗糖(批号PS011655,纯度96.8%)、盐酸黄柏碱(批号PS011586,纯度92.6%)、芒果苷(批号PS011954,纯度98%)、细叶远志皂苷(批号PS011548,纯度99.1%)、五味子醇甲(批号PS011928,纯度99.7%)、特女贞苷(批号PS011752,纯度95.1%)购自成都普思生物科技有限公司;静灵口服液为辽宁东方人药业有限公司生产(批号20190203、20220101、20220303、20220405、20220408、20220409);甲酸为色谱纯,THERMO公司;乙腈、甲醇为色谱纯,MERCK公司;水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为BEH C18(2.1×50 mm,1.7 μm);进样量为2 μL;柱温为40 ℃;流速为0.3 mL/min。流动相为乙腈(A)和0.1%甲酸水溶液(B)。梯度洗脱的参数为0～5 min,2% A→52% A;5～9 min,52% A→100%A;9～9.5 min,100%A→2%A;9.5～10 min,2%A。

2.2 质谱条件 采用电喷雾正、负离子切换扫描模式;毛细管电压3.50 kV,脱溶剂气流为氮气800 L/h,脱溶剂温度350 ℃,锥孔气流为氮气150 L/h,离子源温度为150 ℃,碰撞气体为氮气,检测方式为多重反应检测(MRM)和“准分子”多反应监测过渡,即采用相同的离子作为母离子和子离子(表1)。

2.3 溶液制备

2.3.1 对照品储备液 精密称取对照品盐酸小檗碱、远志口山酮Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖、盐酸黄柏碱、芒果苷、细叶远志皂苷、五味子醇甲和特女贞苷各2.00 mg,分别置于10 mL量瓶中,加甲醇并定容至刻度,制成质量浓度200 μg/mL的对照品储备液备用。

2.3.2 标准工作液 精密吸取远志口山酮Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖、盐酸黄柏碱、芒果苷、细叶远志皂苷、五味子醇甲和特女贞苷对照品储备液各0.1 mL,盐酸小檗碱对照品储备液1 mL,置于20 mL容量瓶中,加入甲醇定容稀释得到混合对照品中间工作液。将混合对照品中间工作液稀释得到远志口山酮Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖、盐酸黄柏碱、芒果苷、细叶远志皂苷、五味子醇甲和特女贞苷的标准工作液浓度为1 000、500、200、100、50、20、10、5、1 ng/mL;盐酸小檗碱的标准工作液浓度为10 000、5 000、1 000、500、250、50 ng/mL。

2.3.3 供试品溶液 精密吸取1 mL静灵口服液,置于50 mL容量瓶中,加入70%甲醇适量,混匀,超声提取15 min,放冷至室温,用70%甲醇定容,经0.22 μm微孔滤膜过滤,取续滤液分析。

2.4 专属性考察 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液,按“2.1及2.2”项下进行测定。对照品中盐酸小檗碱、远志口山酮Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖、盐酸黄柏碱、芒果苷、细叶远志皂苷、五味子醇甲、特女贞苷的保留时间分别为4.23、3.11、5.40、2.81、2.78、4.63、5.49、3.41 min,与供试品溶液色谱图中各成分保留时间相同,表明专属性良好(图1)。

A:混合对照品溶液;B:样品溶液;1:盐酸小檗碱,2:远志口山酮Ⅲ,3:3,6′-二芥子酰基蔗糖,4:黄柏碱,5:芒果苷,6:细叶远志皂苷,7:五味子甲醇,8:特女贞苷。

2.5 线性关系考察 以混合标准工作液的稀释浓度(X)为横坐标,目标物峰面积(Y)为纵坐标,计算8种物质的回归方程,结果显示各成分线性关系良好(表2)。

表2 8种有效成分的线性关系结果及LOD和LOQ浓度

2.6 精密度试验 取供试品溶液,按“2.1及2.2”项下测定,连续进样6次,计算各峰面积,结果盐酸小檗碱、远志口山酮Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖、盐酸黄柏碱、芒果苷、细叶远志皂苷、五味子醇甲、特女贞苷的峰面积RSD(n=6)分别为1.05%、2.44%、3.33%、1.75%、2.38%、3.13%、2.80%、3.88%,表明方法精密度良好。

2.7 稳定性试验 取供试品溶液,分别于0、3、10、15、24 h进样,测定盐酸小檗碱、远志口山酮Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖、盐酸黄柏碱、芒果苷、细叶远志皂苷、五味子醇甲、特女贞苷的峰面积RSD(n=6)分别为2.62%、3.96%、1.79%、2.30%、3.81%、3.01%、1.45%、3.45%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验 按“2.3.3”项下方法平行制备6份供试品溶液,分别进样2 μL,测定8种目标物质的峰面积。结果盐酸小檗碱、远志口山酮Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖、盐酸黄柏碱、芒果苷、细叶远志皂苷、五味子醇甲、特女贞苷含量的平均值分别为29.3、8.07、10.19、20.59、0.48、11.59、4.30、10.03 μg/mL,RSD(n=6)分别为1.84%、2.31%、1.83%、1.03%、2.07%、2.53%、0.73%、2.67%,均符合规定,表明该方法重复性良好。

2.9 检测下限和定量下限 按要求量取空白溶剂,通过加入最低可接受浓度的样品空白来确定方法检出限(LOD),重复进样至少10次。计算标准偏差,以3倍标准偏差为检测限,10倍标准偏差为定量限(LOQ),结果见表2。

2.10 加样回收率试验 精密量取已知含量的同一批样品(批号为20220101)1 mL,置于50 mL量瓶中,分别添加适量的标准溶液,按“2.3.3”项下方法制备回收率试验供试品溶液,一式9份,平行3份,按“2.1及2.2”项下测定,记录峰面积,计算回收率及其RSD,结果见表3。

表3 加样回收率试验(n=9)

2.11 含量测定 取供试品6批,每批取6份,分别按“2.3.3”项方法制备供试品溶液,按“2.1及2.2”项下测定,分别计算静灵口服液中盐酸小檗碱、远志口山酮Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖、盐酸黄柏碱、芒果苷、细叶远志皂苷、五味子醇甲、特女贞苷的含量,现行标准规定小檗碱的含量不得少于8 μg/mL,测定的6个批次均达到要求,结果见表4。

表4 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 样品处理方法的选择 本实验对提取溶剂及提取方法进行了优化筛选,使静灵口服液的定量研究更为准确。分别考察纯甲醇、70%甲醇、30%甲醇和水为溶剂进行超声提取,结果显示使用70%甲醇提取时8种成分含量均较高。同时也考察了用70%甲醇超声时间15、30、60 min对8种成分的提取效果,结果显示超声处理15 min后,成分含量已无明显变化。因此,我们选择了70%甲醇作为提取溶剂,并采用超声提取15 min的方法进行样品处理。

3.2 检测方法的选择 实验前期曾采用HPLC-UV法测定静灵口服液中8种成分的含量,结果芒果苷、细叶远志皂苷、五味子醇甲,基线漂移,噪音影响大,难以准确检测,而UPLC-MS/MS具备了液相色谱分离效能高和质谱灵敏度高、定量下限低的优点,在定量分析中更有优势[17-18]。同时,鉴于静灵口服液组成复杂,存在杂质峰对主峰影响较大的情况,我们选择UPLC-MS/MS进行分析,能有效克服常规检测方法所存在的缺陷,获得更加准确、可靠的检测结果。

3.3 质谱条件的优化 UPLC-MS/MS在多反应监测(MRM)和选择离子扫描(SIM)模式下进行检测。虽然MRM模式可以减少样品中基质的干扰,但是一些特殊化合物在碰撞能下容易产生低灵敏度的碎片离子,从而无法满足定量分析的要求。相比之下,SIM模式在某些化合物的分析中表现出更好的灵敏度,但是对于复杂的中药样品会产生更多的分析干扰[19-20]。为了解决这些问题,本研究采用了“准分子”MRM过渡模式。这种模式可以在相同的离子作为母离子和子离子的情况下,同时解决分析干扰因素和提高分析灵敏度的问题。按照文献[21],本研究优化了质谱条件,并采用了MRM和“准分子”MRM过渡两种模式,以提高分析灵敏度并满足定量分析的要求。

3.4 目标物的选择 静灵口服液中治疗多动症的主要药物之一是远志,远志具有宁心安神的作用,临床可用于治疗失眠、健忘。远志之所以能治疗这类精神疾病,是其化学成分中的三萜皂苷、糖酯类和生物碱,能对5-羟色胺等受体起到不同程度的激动作用[22]。本研究主要针对远志中的远志口山酮Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖和细叶远志皂苷这3种质量标志物进行了检测。此外,根据静灵口服液的临床应用[23]和质谱条件的优化,还对知母、五味子和女贞子中的质量标志物进行了检测,为建立静灵口服液的多指标含量检测标准提供了参考。

本研究采用UPLC-MS/MS法同时检测了静灵口服液中8种主要成分的含量,经过实验证明,该方法准确可靠,重复性好,灵敏度高,可以为该制剂的质量控制提供可靠的依据。