通关藤抗结直肠癌活性及作用机制研究进展

结直肠癌已成为严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一。最新统计数据显示,2020年结直肠癌在世界范围内发病人数1 931 590人,发病率居第3位(10.0%),死亡人数935 173人,病死率居第2位(9.4%)[1]。预计2040年其发病人数和死亡人数将分别增加到320万和160万[2]。在临床实践中,结直肠癌的治疗方式已从手术治疗为主、放化疗为辅,过渡到联合免疫治疗、基因靶向治疗和中医药治疗的多学科诊疗模式。即便如此,受经济条件和医疗条件的限制,多数直肠癌患者确诊时已进入中晚期,失去手术机会。后续治疗也常常面临肿瘤复发、放化疗不良反应、肿瘤耐药等困难。最新的免疫治疗、基因靶向治疗也面临自身免疫病、靶向药物与基因检测不匹配等窘境;同时其高昂的治疗费用,使部分肿瘤病人望而却步。与之相比更为便宜经济、副作用小的中医药治疗则展现出巨大的优势。大量证据表明中药在结直肠癌的临床治疗中,具有良好的治疗效果,受到临床工作者的广泛关注。

中药通关藤是萝藦科植物通关藤Marsdeniatenacissima(Roxb.)Wight et Arn.的干燥藤茎,是我国西南地区常用的民族药之一。据《中华本草》记载,通关藤别名通光藤、乌骨藤、通关散等,性苦,微寒,归肺经;多用于喘咳痰多、产后乳汁不通、风湿肿痛、疮痈等疾病的辨证论治[3]。近年来通关藤药材及其制剂广泛用于临床抗肿瘤治疗中,有着大量的临床使用经验。通关藤提取物制剂(商品名“消癌平”)目前已投入临床使用,并且在结直肠癌[4]、肺癌[5]、肝癌[6]和胃癌[7]等多种癌症的临床治疗中取得了良好的疗效。但目前对于通关藤抗肿瘤,尤其是抗结直肠癌的机制研究还较为缺乏,亟需科研工作者阐明作用机理,为临床应用提供依据。本文对通关藤抗结直肠癌活性及机制进行归纳总结,以期为通关藤的开发利用积累资料,为结直肠癌的临床用药提供新思路。

1 通关藤的成分

通关藤所含化学成分种类丰富,活性多样。目前研究表明,通关藤主要含有C21甾体苷、三萜皂苷、多糖、醇类、挥发油、生物碱、有机酸等多种化学成分[8],见表1。其中,通关藤富含的C21甾体苷类被认为是通关藤发挥抗癌活性的主要活性成分[9],包括通关藤苷A、B、G、H、I等成分,已成为国内外学者研究的热点。研究发现,这些成分除了能够抑菌、抗炎、抗氧化、抗高尿酸血症、抗骨质疏松[10-11],还具有良好的抗肿瘤作用,能够阻滞肿瘤细胞周期[12],诱导肿瘤细胞凋亡[13-14],抑制肿瘤细胞增殖和迁移[15-16],抑制肿瘤血管生成[17],逆转肿瘤耐药[18-19]。三萜类成分,例如白桦脂醇、白桦脂酸、羽扇豆醇等,除了能够改善老年痴呆[20]、抗炎[21-22]、抗焦虑[23],也能通过抑制肿瘤细胞增殖迁移、诱导肿瘤细胞凋亡、提高NK细胞杀伤力、抑制肿瘤血管生成的方式[[24-26],发挥抗肿瘤效果。多糖类成分,例如葡聚糖、杂多糖等,表现出增强免疫调节[27]、抑菌[28]等作用。通关藤中的有机酸成分亦有优秀的药理活性,例如绿原酸能保护H2O2造成的细胞损伤[29],咖啡酸保护紫外线损伤人角质形成细胞[30],绿原酸和没食子酸上调caspase 3、caspase 9、P21和P53的表达,下调Bcl-2和NF-κB,诱导ROS产生,导致细胞周期阻滞,以及肿瘤细胞凋亡[31-33],白桦酸通过调控miR-508-5p/CDCA5通路调控结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭[34]。除此之外,通关藤的其他成分比如胡萝卜苷、东阆菪素等,也有抗肿瘤、抗炎、抗氧化的相关报道[35-37]。 通关藤成分的药理活性(表1)。

表1 通关藤成分与药理活性研究概况

2 通关藤在结直肠癌治疗中的临床应用

随着结直肠癌的发病率和死亡率不断增加,近年来,通关藤抗结直肠癌的应用受到临床工作者的广泛关注。目前结直肠癌的临床治疗仍以手术配合放化疗为主。但由于治疗效果不稳定以及随着治疗所带来的各种不良反应,严重影响了患者的生存时间和生存质量。在临床上已有多种通关藤提取物制剂用于结直肠癌的治疗,如通关藤提取物的商品化药物消癌平注射液联合FOLFRI方案[38]、XELOX方案[39]等,以期能改善结直肠癌的临床治疗效果。

有研究显示,通关藤能够有效改善结直肠癌患者的免疫力,增强放化疗效果,降低放化疗的副作用,改善患者的生存质量以及延长生存时间。与单纯使用化疗方案相比,联合使用“消癌平”可以明显降低结直肠癌患者CEA、CYFRA21-1、RBP4、CA19-9、CA72-4等血清肿瘤标志物,有效改善白细胞、中性粒细胞、血小板减少等骨髓抑制反应,缓解恶心、呕吐等症状[40-42],提高化疗效果,减轻化疗不良反应。在结直肠癌术后放疗中,联合使用“消癌平”片,也可以提高临床获益率和客观缓解率,改善因放疗引起的白细胞降低、血红蛋白降低、神经毒性、胃肠道反应、放射性肠炎及放射性皮炎等毒副作用[43],达到增效减毒的目的。一项人群实验表明,使用“消癌平”联合化疗方案治疗后,不仅可以提高临床化疗有效率,降低骨髓抑制反应,而且晚期结直肠癌患者中位进展期从9.70个月延长至11.80个月、中位生存期从13.10个月延长至14.93个月、1年生存率从45.19%提高至52.19%,2年生存率从25.19%提高至34.62%,明显延长患者生存时间[44]。刘帆等[45]探讨消癌平注射液治疗结直肠癌的临床疗效及安全性时,发现消癌平注射液保留灌肠不仅可以提高化疗疗效,而且可以减轻患者腹胀、便秘、腹泻等临床症状,显著提高患者生存质量。除此之外,“消癌平”注射液在提升患者Karnofsky评分、改善患者体力和体重方面,同样表现出良好的效果[46]。这些临床数据提示“消癌平”具有巨大的临床价值。

3 通关藤抗结直肠癌的作用机制

通关藤的抗结直肠癌活性已经被大量临床应用证实,但其药理作用机制有待进一步研究。本文将从阻滞肿瘤细胞周期、抑制肿瘤细胞迁移、促进肿瘤细胞凋亡、免疫调节、抑制肿瘤血管生成以及逆转肿瘤细胞耐药性方面,总结通关藤抗结直肠癌的活性及相关作用机制。以期为通关藤结直肠癌治疗的临床研究提供参考。

3.1 阻滞肿瘤细胞周期 在生物体内,细胞必须有序地完成细胞周期中的关键事件,如DNA 复制和染色体分离等,细胞周期失调可导致细胞异常增殖[47]。据报道,通关藤可通过作用于细胞周期调控的信号转导途径,阻滞细胞周期,抑制结直肠癌细胞的增殖。通关藤中C21甾体苷类成分通关藤皂苷G可阻止结直肠癌RKO细胞和LoVo细胞从G1期进入S 期,从而导致细胞阻滞于G0/G1期,抑制肿瘤细胞增殖。其作用机制可能为通过激活ATM-Chk2-p53信号通路,进而激活细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂p21,抑制相关周期蛋白CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1和Cyclin E,使细胞周期停滞于G0/G1期[48]。通关藤中有机酸成分抗结直肠癌活性也有相关报道,例如绿原酸可能通过诱导ROS产生,使HT-29和LoVo细胞周期停滞[31-32]。三萜类成分白桦脂酸被报道可以通过上调miR-508-5p,靶向抑制细胞周期相关转录子(CDCA5),阻滞细胞周期[34]。没食子酸则可以使SW480细胞阻滞于S期和G2/M期,可能跟没食子酸与DNA四联体结合使DNA四联体稳定进而造成DNA损伤,诱导ROS产生有关[33,49]。这些具有调控细胞周期活性的有机酸成分,均在“消癌平”注射液中被检出[50]。因此该制剂可能具有很好的延缓肿瘤生长作用,进而为结直肠癌病人的治疗创造时间窗口。

3.2 抑制肿瘤细胞迁移 肿瘤细胞的迁移和侵袭活性,可以导致肿瘤细胞进入血管以及外渗到二级淋巴器官,在结直肠癌的转移中起着重要作用。早期结直肠癌患者一般无明显症状,确诊时有很大几率已经发生转移。由于结直肠癌的高转移是患者死亡的主要原因之一,因此通关藤能否抑制肿瘤细胞迁移值得特别关注。细胞划痕实验中,通关藤三萜类成分白桦脂酸以剂量依赖性降低HT-29细胞迁移距离[34,51]。与绿原酸共培养后,HT-29和SW480细胞划痕修复速率下降,证明绿原酸可以抑制结直肠癌细胞水平迁移能力[52]。通关藤皂苷H以剂量依赖的方式抑制人类结肠癌LoVo细胞的增殖和迁移,可能与通关藤皂苷H下调GOLPH3表达、抑制PI3K/AKT/mTOR和Wnt/β-cantenin信号通路的活性有关[53]。“消癌平”联合奥沙利铂+卡培他滨治疗结肠癌时,可以下调结肠癌组织中趋化因子CXCL12及其受体CXCR4表达,即通过CXCR4-CXCL12信号通路抑制肿瘤细胞迁移和侵袭,阻止结肠癌的增殖转移,发挥抗肿瘤活性[54]。有动物实验证明,咖啡酸可以有效抑制小鼠结肠癌细胞CT-26肺转移,可能与抑制ERK磷酸化有关[55]。以上数据显示通关藤及其提取物能够有效抑制肿瘤细胞迁移,可能在治疗和预防肿瘤转移方面具有巨大潜力。

3.3 促进肿瘤细胞凋亡 细胞凋亡在组织的发育、维持稳态和消除不必要或损坏细胞中起着重要作用[56]。因此,研究通关藤通过诱导肿瘤细胞凋亡治疗结直肠癌具有重要意义。有研究人员观察到通关藤苷G可以诱导DNA双链断裂造成肿瘤细胞DNA损伤,激活ATM并使其诱导下游蛋白CHK2磷酸化,进一步激活p53,并引起p53介导的细胞凋亡,表明通关藤可以通过ATM-CHK2-p53信号通路诱导结直肠癌细胞凋亡[48]。通关藤苷H抑制PI3K/AKT/mTOR和Wnt/β-cantenin信号通路,抑制肿瘤细胞迁移的同时,也显著诱导结直肠癌LoVo细胞凋亡,从而抑制结直肠癌发展[53]。通关藤另一种成分咖啡酸亦可以参与Wnt/β-catenin信号通路,进而促进HT-29细胞凋亡,可能与诱导ROS产生相关[57]。没食子酸和绿原酸也表现出与咖啡酸相同的作用和机制[31,33]。经白桦脂酸处理后,HT-29和SW480细胞中促凋亡标志物Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9以剂量依赖性升高,而抗凋亡标志物Bcl-2降低,表明白桦脂酸也可以促进HT-29和SW480细胞凋亡[58]。另有研究表明,白桦脂酸对HT-29的促凋亡作用,可能与参与抑制NF-κB和STAT3信号通路有关[59]。当前众多研究显示,诱导细胞凋亡是抗结直肠癌的重要作用机制。通关藤通过促进细胞凋亡进而发挥抗结直肠癌活性,或许是未来通关藤药理机制的一个重要研究方向。

3.4 免疫调节 通过增强机体的免疫力,改善肿瘤微环境的炎症反应,或解除肿瘤介导的免疫抑制及免疫逃逸,是抗癌的一种新方式。在此方面,传统中医药明显有强大的优势。“消癌平”能够以剂量依赖性关系,显著促进刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)和脂多糖(LPS)诱导的正常淋巴细胞增殖,同时对造血干细胞的集落形成能力没有显著影响,表明通关藤提取物在体外不仅能够有效促进淋巴T、B细胞增殖,而且对造血干细胞无明显的细胞毒作用[60]。临床上应用“消癌平”,不但能够显著降低结肠癌病人血清中CEA、CYFRA21-1、RBP4、CA19-9等肿瘤标志物水平,同时能够降低外周血T淋巴细胞亚群CD8+T水平,提高CD4+T、CD4+T/CD8+T和NK细胞水平[54,61]。另有研究报道,通关藤提取物可以下调结直肠癌细胞中TGF-β1的分泌和PD-L1的表达,抑制Treg的分化,增强小鼠和患者的抗肿瘤T细胞反应,逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态,发挥抗癌作用[62]。在结直肠癌治疗中,没食子酸联合抗PD-1抗体不仅通过破坏PD-L1/PD-1信号通路和下调Foxp3稳定性,显著抑制Treg细胞的功能,还可促进CD8+T细胞产生IFN-γ,从而限制肿瘤的生长[63]。以上研究揭示,通关藤可以调节免疫细胞,动态平衡免疫力从而发挥抗肿瘤作用。

3.5 抑制肿瘤血管生成 丰富的血供是恶性肿瘤的特征之一,血管生成在结直肠癌的恶性进展中起重要作用。因此,从天然药物中开发肿瘤血管生成阻断剂已成为研究热点。在一项关于通关藤提取物抑制新生血管生成的分子机制的研究中,发现通关藤提取物能够以剂量依赖的方式抑制人脐静脉内皮(HUVEC)细胞增殖、代谢以及迁移,诱导HUVEC细胞的早期凋亡,将细胞周期阻滞在S期,并且影响Caspase-3,Bcl-2,VEGFR等相关基因的表达,另外通过鸡胚实验,观察到通关藤提取物显著抑制了新生血管生成,以上结果表明通关藤能有效抑制血管生成[64]。趋化因子CXCL12和血管内皮生长因子具有协同作用,共同促进肿瘤内新生血管生成[65],阻断CXCR4-CXCL12信号传导可减少肿瘤血管生成。因此可以推测通关藤能够通过抑制CXCR4-CXCL12信号通路[54],减少肿瘤内血管生成,抑制肿瘤生长,发挥抗结直肠癌活性。白桦脂酸在体外和体内均可通过下调转录因子特化蛋白1(Sp1)水平,抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达,进而延缓肿瘤发展[26]。深入研究通关藤抑制肿瘤血管生成作用,对从多途径阐明通关藤抑制肿瘤生长具有重要的意义,为将通关藤开发成抗结直肠癌药物奠定基础。

3.6 逆转肿瘤细胞耐药性 手术切除、化疗和放疗是结直肠癌治疗的主要手段,但肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是化疗的最大阻碍,肿瘤细胞产生耐药性的机制是亟需解决的科学问题。因此,筛选高效低毒的增敏剂对提高结直肠癌的临床疗效具有重要意义。通关藤中含有的多氧孕甾烷不仅可以增加紫杉醇在肿瘤内的蓄积,而且能够恢复ATP结合盒亚家族B成员1 (ABCB1)过表达的肿瘤细胞的化疗敏感性,同时不会诱导细胞色素P450酶系统 ( CYPs ) 与ABCB1相互反应,避免重复给药后引起CYPs与ABCB1发生复杂的药代动力学反应,证明通关藤能够在不引起毒性反应的同时,可以克服ABCB1介导的耐药性[66]。通关藤苷G不但能够促进肿瘤细胞凋亡,还可能通过激活caspase级联,增加DNA损伤程度,以及诱导p53磷酸化,增强5-氟尿嘧啶对人结直肠癌细胞的抑制活性[67]。白桦脂酸也表现出类似的作用,可以引起p53突变的HT-29和SW480细胞增加对5-氟尿嘧啶和多柔比星的敏感性[68]。这些研究证明通关藤可以逆转结直肠癌细胞的耐药性,提高化疗药物生物利用度。进一步研究通关藤参与调控肿瘤细胞耐药性的分子机制,可为化疗药物耐药性逆转提供更多有益的线索。

4 展望

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在所有癌症中均居于前列。结直肠癌的治疗以手术为主,放化疗为辅,配合免疫治疗、基因靶向治疗等治疗手段。但仍面临着术后复发、放化疗不良反应、高额的治疗费用等问题。

近年来发现许多中药或来源于中药的药理活性成分,具有良好的抗癌作用,因此从中药中开发抗癌药物成为研究热点之一,其中即包括对中药通关藤的研究。研究显示,通关藤具有抗结直肠癌活性,可以通过阻滞肿瘤细胞周期、抑制肿瘤细胞迁移转移、促进肿瘤细胞凋亡、调节免疫、抑制肿瘤血管生成、逆转肿瘤细胞耐药性等方面,发挥抗肿瘤作用;并且其提取物制剂已在临床广泛使用,在改善结直肠癌患者血液指标、减轻化疗反应、提高患者生存质量、延长生存时间等方面具有一定的功效,具有较好的药用价值和研发潜力。本文对通关藤抗结直肠癌活性及作用机制进行综述,以期为通关藤的开发和应用积累资料。

随着研究技术不断进步,通关藤中的药理活性成分也不断被发现和研究,但是由于其成分复杂多样,通关藤仍然具有很大的研究价值和开发空间。目前通关藤的抗肿瘤活性已经有明确的临床数据支撑,其内在机制也有相关研究结论:通关藤可能通过调控ErbB2-GSK3β-HIF1α信号轴、AKT/GSK3β/STAT3信号轴发挥抗前列腺癌作用[69-70];通过抑制肝癌衍生生长因子的表达和促进巨噬细胞由M2型向M1型极化,阻滞非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、转化[71];通过降低负责吉非替尼外排的ATP结合盒转运蛋白G2(ABCG2)的活性来促进吉非替尼在肿瘤组织中的长期蓄积抗非小细胞肺癌[72];激活MIF和抑制mTOR信号通路抑制MHCC-97H和HepG2细胞增殖,诱导细胞发生自噬、凋亡和S期阻滞[73];通过lncMEG3/miR-542-3p/SFRP1/Wnt/β-catenin轴抑制胶质瘤[74]等。这些信号通路的研究,将为更广泛、深入地研究通关藤在抗结直肠癌方面的作用机制提供切入点。此外,还可以利用现代研究技术对通关藤的药理机制进行更为系统的研究。首先通过构建不同类型和亚型的结直肠癌动物模型,验证通关藤的治疗效果;然后选取动物模型的组织作为样本,进行测序(包括单细胞RNA测序和单细胞基因组测序) 以确定对药物治疗产生显著变化的不同结直肠癌亚型、基因;接下来利用标记RNA亲和纯化(TRAP)技术和药物亲和反应的靶点稳定性(DARTS)技术等方法在靶细胞中寻找通关藤的结合蛋白,然后利用等温滴定测热法(ITC)、表面等离子体共振(SPR)和微尺度热泳(MST)来确认目标蛋白的结合,最后通过运用细胞水平和动物水平的基因敲低或/和过表达,来验证目的蛋白的生物学功能,并通过下游通路分析来确定通关藤与目的蛋白结合对疾病进展的影响[75],为通关藤在抗结直肠癌方面发挥更高效、精准的治疗提供充足的理论依据。

总体而言,基于通关藤良好的抗结直肠癌活性,今后应开展多中心临床和基础研究,为通关藤在结直肠癌的临床治疗中提供更多循证支持,从而为通关藤的开发提供更精准有力的证据。