消癌舒胶囊急性毒性及长期毒性的实验研究

消癌舒来源于贵州省少数民族民间验方,主要由斑蝥、牡蒿、牛蒡3味药组成,具有“破血逐淤,散结消癥,攻毒蚀疮”等功效[1-2]。民间使用发现其对宫颈癌具有显著疗效,故拟作为6类新药进行研发。目前缺乏对消癌舒用药安全性评价的研究,根据《药品注册管理办法》[3],消癌舒属于未在国内上市销售的由中药、天然药物组成的非注射给药复方制剂,处方符合中医药理论,有一定的民间用药经验,故采用啮齿类动物,按拟临床给药途径(口服)进行急性毒性及长期毒性研究进行药物安全性评价。通过急性毒性试验观察小鼠的外观、活动情况、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应,通过长期毒性试验观察消癌舒长期给药后对大鼠体质量、摄食量、血液学、血清生化、脏器系数及组织病理学的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性KM小鼠60只,体重(20±2)g,由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供,合格证号为SCXK(渝)2007-2006;雌性SD大鼠120只,体重(200±20) g,由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供,合格证号为SCXK(渝)2012-0005;饲养于遵义医科大学基础药理教育部重点实验室SPF级动物房。动物实验符合动物伦理要求。

1.2 试剂与仪器 消癌舒胶囊(由贵州景红生物科技发展有限责任公司提供,批号为20130911,规格为0.4 g/粒)。倒置显微镜(日本 OLYMPUS公司);全自动生化分析仪(日本日立公司);组织脱水机(德国 Leica公司);石蜡包埋机(德国 Leica公司)。

1.3 急性毒性试验

1.3.1 测定半数致死量(LD50) 雌性KM小鼠40只,分别编号并输入Excel表格,通过计算机产生随机数字进行随机分组,每组10只,分别为消癌舒2.36、2.94、3.68、4.6 g/kg组,禁食不禁水12 h 后,单次灌胃给药,每次0.2 mL/10 g,观察小鼠一般情况(体重、饮食、皮毛、行为、分泌物、排泄物等)及中毒、死亡情况,连续观察14 d[4]。

1.3.2 最大耐受量实验 雌性KM小鼠20只,消癌舒27.6 g/kg,分3次灌胃给药,给药容积0.4 mL/10 g(最大给药容积),观察小鼠的外观、活动情况、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应(中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆)等,连续观察14 d,并计算小鼠消癌舒的最大耐受量倍数,小鼠的最大耐受量倍数=每只小鼠的耐受药量/小鼠的平均体重(20 g)×成人的平均体重(50 000 g)/成人每日用量(倍)。

1.4 长期毒性试验

1.4.1 分组与给药 雌性SD大鼠120只,适应性喂养7 d,随机(同上)分为4组,每组30只:空白对照组(蒸馏水)及消癌舒低(1 g/kg)、中(2.3 g/kg)、高剂量组(4.6 g/kg)。消癌舒采用双蒸水配制成相应浓度的混悬液,每日灌胃给药1次,每周给药6 d,停药1 d,连续给药3、6个月。分别于给药3、6个月及停药后1个月(恢复期),每组取10只大鼠标本,进行血液学、血清生化指标及组织病理检查[5]。

1.4.2 大鼠体质量、进食量及一般状况检查 试验期间,每日观察动物的外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便,摄食量(1次/周),体重(1次/周)等。

1.4.3 大鼠血液学检查 末次给药结束24 h后,大鼠称重,使用4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(50 mg/kg)[6],取腹主动脉全血,使用全自动的血液分析仪检测白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)、网织红细胞(RETIC)计数,中性粒细胞(NEUT)、淋巴细胞(LYMPH)、单核细胞(MONO)、嗜酸细胞(EO)、嗜碱细胞(BASO)百分比,血红蛋白(HGB)、平均红细胞血红蛋白(MCHC)浓度,红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白量(MCH)、凝血酶原时间(PT-SEC)。

1.4.4 大鼠血清生化指标检查 大鼠腹主动脉取血,1 500 r/min离心15 min制备血清,使用全自动生化分析仪检测K+、Na+、Cl+浓度、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、尿素氮(UREA)、肌酐(CR)、血糖(GLU)、总胆红素(TBIL)、肌酸磷酸激酶(CK)。

1.4.5 大鼠系统尸检、脏器指数及病理学检查 经腹主动脉采血后处死,取心脏、脑、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、肾上腺、胸腺、子宫、卵巢称重并计算脏器系数,计算公式:脏器指数=脏器重/体重×100%。取心脏、卵巢、子宫、乳腺、脑(大脑、小脑、脑干)、脊髓(颈、胸、腰段)、垂体、胸腺、甲状腺、甲状旁腺、食管、唾液腺、胃、十二指肠、空场、回肠、盲肠、结肠、肝脏、肾脏、肾上腺、脾脏、胰腺、气管、肺、主动脉、坐骨神经、膀胱、骨髓、淋巴结,使用10%福尔马林固定48 h后进行石蜡包埋,制备组织切片(4 μm),HE染色、光学显微镜采集图像分析。

2 结果

2.1 小鼠急性毒性试验 消癌舒各组小鼠实验期间,一般情况良好(体重、饮食、皮毛、行为、分泌物、排泄物等),未见死亡,不能求出半数致死量(LD50);最大耐受量试验期间消癌舒组小鼠活动正常,皮毛光滑,口、鼻、眼等未见异常分泌物及死亡现象,大小便均未见异常,小鼠体重逐渐增加,与对照组比较无差异。小鼠的最大耐受量倍数=每只小鼠的耐受药量/小鼠的平均体重(20 g)×成人的平均体重(50 000 g)/成人每日用量(倍)=27.6 g/1 000 g×19.59 g/20 g×50 000 g/3.6 g(倍)=375(倍)。

2.2 大鼠长期毒性试验

2.2.1 大鼠体质量、进食量及一般状况检查 各组大鼠进食与活动均正常,均未出现呼吸异常、呕吐、流涎或腹泻等现象,大小便正常。给药3个月,消癌舒各剂量组大鼠体重下降,其中高剂量组体重下降最明显,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);给药6个月及停药1个月,消癌舒各剂量组大鼠的体重亦无显著变化(图1)。给药3个月,消癌舒各剂量组大鼠摄食量与对照组比较无显著差异;给药6个月,中、高剂量组摄食量有所降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。停药1个月消癌舒各剂量组大鼠的摄食量均恢复正常(图1)。

A:大鼠摄食量变化;B:大鼠体重变化;*、**:与对照组比较,给药3个月n=30,给药6个月n=20,恢复期1个月n=10。

2.2.2 消癌舒连续给药对大鼠血液学的影响 消癌舒连续给药3个月,给药组RBC、HGB、HCT、MCHC、PLT增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05),其它血液学指标未见异常(表1)。消癌舒连续给药6个月,给药组NEUT增加、LYMPH降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),其它血液学指标未见异常(表2)。消癌舒停药1个月血液学指标均未见异常(表3)。

表1 消癌舒连续给药3个月对大鼠血液学的影响

表2 消癌舒连续给药6个月对大鼠血液学的影响

表3 消癌舒停药1个月(恢复期)对大鼠血液学的影响

2.2.3 消癌舒连续给药对大鼠血清生化指标的影响 消癌舒连续给药3个月,各项血清生化指标未见异常(表4)。消癌舒连续给药6个月,给药组TP、ALB降低,UREA、GLU增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),其它血清生化指标未见异常(表5)。消癌舒停药1个月血清生化指标均未见异常(表6)。

表4 消癌舒连续给药3个月对大鼠血清生化指标的影响

表5 消癌舒给药6个月对大鼠血液生化指标的影响

表6 消癌舒停药1个月(恢复期)对大鼠血清生化指标的影响

2.2.4 消癌舒连续给药对大鼠脏器系数的影响 消癌舒连续给药3、6个月及停药1个月大鼠各脏器指数(心脏、肺脏、胸腺、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺、卵巢、子宫、脑)与空白对照组比较均无明显变化(表7～9)。

表7 消癌舒连续给药3个月对大鼠脏器指数的影响

表8 消癌舒连续给药6个月对大鼠脏器指数的影响

表9 消癌舒停药1个月(恢复期)对大鼠脏器指数的影响

2.2.5 消癌舒连续给药对大鼠脏器组织形态学的影响 消癌舒连续给药3、6个月及停药1个月大鼠各脏器(心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、等)大体检查未发现明显病变,组织病理学检查各脏器均未见明显的与供试品毒性有关的病理病变(图3)。

A:空白组;B高剂量组;HE, ×200。

3 讨论

消癌舒胶囊主要成分斑蝥、刺梨、牡蒿具有抗肿瘤[7-9]、抗病毒[10]、抗氧化[11-13]和免疫调节[14-15]等活性,本课题组前期药效学研究发现[1-2],消癌舒明显抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖及迁移,对小鼠宫颈癌细胞株U14移植瘤及人宫颈癌Hela细胞裸鼠移植瘤具有明显抑制作用,同时消癌舒还具有显著的抗炎和镇痛作用。

KM小鼠急性毒性研究发现,消癌舒毒性较低,未能测出半数致死量,故采用最大耐受量试验。即灌胃给予最大溶解度最大容积的消癌舒27.6 g/kg,24 h内分3次给药,结果发现消癌舒组小鼠外观正常,未见活动减少,嗜睡、蜷缩、松毛等现象,无小鼠死亡,眼、耳、口、鼻未见异常分泌物,体重逐渐增加,与空白组比较无明显差异。说明在此最大给药剂量下(27.60 g/kg),消癌舒对小鼠无明显急性毒性反应,其耐受量是人用量的375倍。

消癌舒对SD大鼠进行长期毒性试验结果表明,消癌舒1、2.3、4.6 g/kg(约相当于临床剂量3、6、12 倍)给药后,消癌舒各剂量组大鼠的体重及摄食量在给药初期均有降低,后期均恢复正常,说明消癌舒在给药早期引起的大鼠体重及摄食量下降可能是因为灌胃刺激所导致,与药物关系不大。消癌舒给药180 d,给药组NEUT、UREA、GLU增加,LYMPH、TP、ALB降低,其它血液学及血清生化指标未见异常,消癌舒停药1个月后,所有血液学及血清生化指标均恢复正常。消癌舒给药3、6个月及恢复期各剂量组大鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、卵巢、子宫等脏器系数均未见明显异常,脏器系数能够反映药物对脏器的影响,反映该实质器官发生萎缩、退行性改变,充血、水肿、增生及肥大等变化[16]。组织病理学检查各脏器均未见明显的与供试品毒性有关的病理病变。

综上所述,本实验研究结果表明消癌舒为无毒或低毒,临床用药量安全,为后续的临床用药试验提供了理论支撑。