靶向纳米材料CFW-CHSc构建纳米给药系统治疗隐球菌感染性肺炎

杨雪松 盛 琪 沈 婷 王海燕 丁 辰 赛思翔

1 滨州医学院药学院 山东 烟台 264003;2东北大学生命与健康学院 辽宁 沈阳 110015

新型隐球菌是一种机会性致病真菌病原体,在环境中无处不在。由其导致的脑膜炎,每年造成全球超过18万人死亡,其中与艾滋病相关的死亡病例占15%。这种感染的高死亡率表明需要改进治疗[1]。吸入环境真菌孢子会导致肺组织中发生新型隐球菌感染。为了抵抗宿主的杀伤和清除,新型隐球菌通过形态改变迅速适应肺环境,包括产生荚膜结构和形成扩大的真菌细胞(Titan细胞)以及产生许多真菌毒力因子[2-3]。隐球菌肺炎是一种由新型隐球菌引起的真菌感染,主要发生在免疫抑制人群中,很少发生在免疫正常人群中。患者肺部隐球菌也可入脑引起真菌性脑膜炎[4-12]。

脂质体主要由磷脂和胆固醇组成,具有疏水性和亲水性区域。它们的结构由疏水作用力和其他分子间作用力维持[13]。脂质体作为基础的药物传递系统显示出诸多优点,例如改善药效学,减少全身和脱靶毒性,延长在循环中的停留时间,以及靶向潜力以获得预期结果[14-16]。两性霉素B(AmB)是一种多烯抗真菌剂,AmB通过与真菌细胞膜成分麦角甾醇结合,引起细胞质成分渗漏(膜损伤),增加真菌细胞膜通透性,最终导致真菌死亡[17-18]。尽管AmB具有一定细胞的毒性,它仍然在治疗危及生命的真菌感染中发挥重要作用[19]。脂质体包封的两性霉素B(AmB-liposome)可用于治疗播散性真菌感染。含有饱和酰基链的磷脂用于将两性霉素B包封在封闭的磷脂双层系统中,可以降低两性霉素B对人体的肝毒性[20-21]。纳米技术被广泛应用于开发新的抗真菌药物和更有效的疫苗[22]。关于抗真菌治疗,纳米颗粒由于其固有的抗真菌活性或作为药物递送载体而被使用,重点是降低治疗所需的药物浓度[23-27]。

钙荧光白(CFW)是常用于真菌鉴定的荧光染料。其可与真菌细胞壁上的几丁质结合,且在紫外光(UV)照射下可见明亮的荧光[28]。前期研究中发现,合成的钙荧光白-胆固醇琥珀酸单酯(CFW-CHSc)具备靶向真菌细胞壁中的几丁质的功能[29]。而隐球菌细胞壁中含有该成分,这为开展构建靶向纳米给药系统治疗隐球菌感染引起的肺炎提供潜在的可能。本研究构建载有两性霉素B的靶向纳米粒CFW-CHSc-AmB-liposome,并初步评价其理化性质及体内外的药效。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 磷脂(上海太伟药业有限公司);甲醇、乙醇、冰醋酸、乙腈;两性霉素B(索莱宝公司);无水二甲基亚砜(DMSO);超滤管(美国Millipore公司);菌株:隐球菌 H99;YPD Broth 培养基;YPD Agar 培养基;YEAST EXTRACT;细胞培养板(NEST 生物科技有限公司);C6-liposome;PBS、水合氯醛;无水乙醇;载玻片、盖玻片;RPMI1640(美国Hyclone公司);FBS(美国Gibco公司);昆明小鼠(济南朋悦实验动物繁育有限公司;许可证号SCXK(鲁)20190003);LE204E-02 电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);Zetasizer Nano ZS 纳米粒度仪(英国 Malvern 公司);5810R 高速离心机(德国 Eppendorf 公司);RV10 旋转蒸发仪(德国 IKA 公司);SP-752PC紫外可见分光光度计(济南捷岛分析仪器有限公司);Scientz-IID超声波细胞粉碎机;LEICA TCS SPE 激光共聚焦显微镜(德国徕卡公司);THZ-98C 恒温振荡器(上海一恒科学仪器有限公司);QB-8002 Mini Shaker;Bio Tek 酶标仪(美国伯腾仪器有限公司);

1.2 实验方法

1.2.1 CFW-CHSc-AmB-liposome制备 采用注入法制备CFW-CHSc-AmB-liposome,将两性霉素B溶于DMSO 中,称取磷脂溶于无水乙醇中,在超声中将两个溶液混合后加入去离子水,再加入CFW-CHSc,制得CFW-CHSc-AmB-liposome。同理制得AmB-liposome。

1.2.2 纳米粒度仪检测粒径电位 利用 Zetasizer Nano ZS 纳米粒度仪测定CFW-CHSc-AmB-liposome 和 AmB-liposome 的粒径分布和表面zeta 电位。

1.2.3 透射电子显微镜(TEM)观察 利用透射电子显微镜观察CFW-CHSc-AmB-liposome 与AmB-liposome的形貌。吸取10 μL样品滴到载有硫膜的铜网上固定8～10 min,待铜网上样品溶液干燥,滴加10 μL 1%磷钨酸溶液染色2 min,室温静置干燥。置于TEM透射电子显微镜下观察CFW-CHSc-AmB-liposome 与AmB-liposome形貌特征。

1.2.4 两性霉素B标准曲线建立 使用C18反相色谱柱(4.6×250 mm内径,5 μm),以乙腈-20 nmol/L:乙二胺四乙酸二钠=38∶62作为流动相,流速为1.0 mL·min-1,检测波长为405 nm,进样量20 μL。用乙腈将两性霉素B进行系列稀释,测量两性霉素B色谱峰面积,建立两性霉素B标准曲线。

1.2.5 CFW-CHSc-AmB-liposome 和AmB-liposome的包封率和载药量测定 通过间接计算确定两性霉素B的包封率(entrapment efficiency,EE)和药物载量(drug loadings,DL)。取1 mL CFW-CHSc-AmB-liposome、AmB-liposome于超滤管(10 kDa)中10 000 rpm/min离心1 h。收集滤液,用高效液相色谱法测定其中两性霉素B的浓度,记为游离的药物浓度。将100 μL的脂质体与900 μL的甲醇混合超声破乳15 min,用高效液相色谱法测定其中两性霉素B的浓度为总药物量。两性霉素B的EE (%) 和DL (%) 根据(1-1)和(1-2)公式计算。

(1-1)

(1-2)

1.2.6 CFW-CHSc-C6-liposome递送效率 隐球菌H99分别与C6-liposome和CFW-CHSc-C6-liposome同孵育1、3、6、9 h。然后3 000 r/min离心5 min,PBS洗涤2次,重悬浮于10 μL PBS中进行激光共聚焦显微成像。使用Image J得到纳米颗粒荧光强度的平均灰度值,使用GraphPad Prism v.9.0作图分析。统计分析采用单因素方差分析,T检验进行显著性差异比较,统计学显著性差异为*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

1.2.7 CFW-CHSc-AmB-liposome体外药效研究 将1×105CFU/mL的隐球菌加入到96孔板中。将倍比稀释的CFW-CHSc-AmB-liposome和AmB-liposome分别加入到实验组和对照组中。将96孔板放置于摇床中30 ℃,孵育24 h。酶标仪600 nm处测吸光值,根据公式(1-1)计算抑菌率,使用GraphPad Prism v.9.0作图分析。统计分析方法同上。

1.2.8 CFW-CHSc-AmB-liposome小鼠体内药效研究 随机选取20只小鼠,进行小鼠隐球菌肺炎造模。小鼠感染后第5天进行CFW-CHSc-AmB-liposome和AmB-liposome尾静脉给药,按照小鼠平均体质量两性霉素B药物浓度0.8 mg/Kg进行给药。感染后第10天脱颈处死小鼠,将破碎好的肺组织匀浆进行涂布平板,30℃培养两天,观察菌落数量。统计分析方法同上。

2 结果

2.1 CFW-CHSc-AmB-liposome的理化性质的表征 由图1(D)可知AmB-liposome平均粒径为203.7 nm,由图1(B)可知CFW-CHSc-AmB-liposome平均粒径为158.9 nm。粒径分布范围较窄,呈正态分布,粒径较为均一。AmB-liposome 表面 Zeta 电位为-22.4 mV。CFW-CHSc-AmB-liposome表面 Zeta 电位为-13.5 mV。由图2可见CFW-CHSc-AmB-liposome、AmB-liposome、CFW-CHSc-AmB-liposome与AmB-liposome均呈均匀球型,大小均一,具有良好分散性。

A.CFW-CHSc-AmB-liposome Zeta电位;B.CFW-CHSc-AmB-liposome 粒径;C.AmB-liposome Zeta电位;D.AmB-liposome粒径。

A.CFW-CHSc-AmB-liposome TEM;B.AmB-liposome TEM。

2.2 AmB-liposome对AmB负载研究 根据(1-1)(1-2)计算公式可得,AmB-liposome的包封率为89.82%,载药率为9.23%,CFW-CHSc-AmB-liposome的包封率为92.23%,载药率为9.83%,表明脂质体也能对两性霉素B实现较好的包载。

2.3 CFW-CHSc-C6-liposome在隐球菌中体外递送效率结果 为了评价经CFW-CHSc修饰的纳米粒的体外递送效率,构建了载有香豆素6 (C6)的纳米粒CFW-CHSc-C6-liposome。通过观察在不同条件下隐球菌细胞内的荧光信号强度反映纳米粒递送效率的差异。如图3(A-H),通过共聚焦显微镜可以很明显观察到在CFW-CHSc-C6-liposome处理组中隐球菌胞内荧光信号强度在各时间段内显著高于C6-liposome组。通过使用Image J软件处理分析,将细胞摄取荧光信号强度转化为平均灰度值进行比较。如图3(I),隐球菌细胞摄取C6-liposome产生的胞内荧光强度的灰度值随C6-liposome共同孵育时间的延长而增加,在6 h达到了灰度值的最高值随后下降。这可能是因为在9 h处隐球菌细胞已经代谢掉了一部分摄取的C6。在隐球菌CFW-CHSc-C6-liposome处理组的各时间点,灰度值均显著高于相应的C6-liposome处理组。与含有C6-liposome共孵育1 h、3 h、6 h和9 h情况相比,细胞摄取CFW-CHSc-C6-liposome的平均灰度值均高于C6-liposome。在1 h处理组中,细胞摄取CFW-CHSc-C6-liposome的平均灰度值比摄取C6-liposome的平均灰度值高大约0.8倍。在3 h处理组中,细胞摄取CFW-CHSc-C6-liposome的平均灰度值比摄取C6-liposome的平均灰度值高大约3倍。在6 h处理组中,细胞摄取CFW-CHSc-C6-liposome的平均灰度值比摄取C6-liposome的平均灰度值高大约2.5倍。在9 h处理组中,细胞摄取CFW-CHSc-C6-liposome的平均灰度值比摄取C6-liposome的平均灰度值高大约7.5倍。此结果表明,经CFW-CHSc修饰的脂质体可以提高纳米粒在隐球菌细胞中的递送效率。

A～D.隐球菌摄取 CFW-CHSc-C6-liposome荧光强度;E～H.隐球菌摄取C6-liposome荧光强度;I.Image J处理荧光强度。n=5,***P<0.001。比例尺10 μm。

2.4 CFW-CHSc-AmB-liposome体外药效研究 如图4,两性霉素B 药物浓度在0.25～32 μg/mL时AmB-CFW-CHSc 脂质体与AmB-liposome抑菌率大致相同,抑菌效果在95%左右。两性霉素B浓度在0.125和0.062 5 μg/mL 时CFW-CHSc-AmB-liposome抑菌效果依旧维持在95%左右,而AmB-liposome抑菌效果显著降低至 24%,由此可见在体外实验中CFW-CHSc-AmB-liposome抑菌效果在所测试的药物浓度范围内均具有显著抑菌效果。这表明经CFW-CHSc修饰的纳米粒在体外抗隐球菌药效中优于传统脂质体。

n=3,**P<0.01,***P<0.001。

2.5 CFW-CHSc-AmB-liposome体内药效评价 为了评价经CFW-CHSc修饰的纳米粒在小鼠隐球菌引起的肺部感染治疗效果,构建了小鼠隐球菌肺部感染模型。经AmB、AmB-liposome、CFW-CHSc-AmB-liposome治疗后,根据破碎涂板中平板上生长的菌落数量反应小鼠肺内感染隐球菌情况。菌落数量与肺部感染呈正相关。由图5可以发现与AmB治疗组和AmB-liposome治疗组相比,CFW-CHSc-AmB-liposome治疗组小鼠肺内菌落数明显降低,Log10的值达到5.78。与AmB-liposome治疗组,差值平均值为0.75。此结果表明在CFW-CHSc-AmB-liposome治疗组中,小鼠肺部感染情况优于其他治疗组。经CFW-CHSc修饰的载两性霉素B纳米粒较未经修饰的载药脂质体和游离药物在体内抗隐球菌药效更好。

n=5,**P<0.01,***P<0.001。

3 讨论

本研究采用注入法制备了CFW-CHSc-AmB-liposome与AmB-liposome,并对其进行理化性质的表征研究。CFW-CHSc-AmB-liposome 与AmB-liposome均具有较小的粒径,呈正态分布,多分散指数较小,所制脂质体表面 Zeta 电位均为负电位。并且包封率和载药率较高。这表明,脂质体能对AmB 进行充分的包载。体外递送效率研究可以观察到,在相同时间处理组内CFW-CHSc提高了隐球菌细胞摄取CFW-CHSc-C6-liposome。在体外药效评价中,药物浓度较高情况下,CFW-CHSc-AmB-liposome和AmB-liposome均有较高的抑菌率,但是在两性霉素B药物浓度降低时经CFW-CHSc修饰的脂质体比普通传统脂质体有更强的药效。在小鼠感染隐球菌肺炎模型中观察到,CFW-CHSc-AmB-liposome治疗组比AmB-liposome治疗组肺内菌落数低,小鼠肺内感染情况显著减轻,CFW-CHSc-AmB-liposome较AmB-liposome展现出更好的治疗效果。本研究为开展隐球菌感染的肺炎的靶向抗真菌药物递送治疗,提供了新的方法和思路。