温度对棉花黄萎病发生及寄主防御反应的影响

2023-12-28张亚林蒋艳赵丽红冯自力冯鸿杰魏锋周京龙朱荷琴马峙英

中国农业科学 2023年23期

张亚林，蒋艳，赵丽红，冯自力，冯鸿杰，魏锋，周京龙，朱荷琴，马峙英

张亚林1,2，蒋艳2，赵丽红2，冯自力2，冯鸿杰2，魏锋2，周京龙2，朱荷琴2，马峙英1

1河北农业大学农学院/华北作物改良与调控国家重点实验室/河北省作物种质资源重点实验室，河北保定 071000；2中国农业科学院棉花研究所/棉花生物育种与综合利用全国重点实验室，河南安阳 455000

【目的】解析不同温度对棉花黄萎病发生的影响以及调控寄主防御反应的机理，揭示温度对病原菌和寄主的双重作用，为该病害的绿色防控和温度调控研究提供理论依据。【方法】以棉花抗病品种中植棉2号（ZZM2）、感病品种冀棉11（JM11）为试验材料，采用室内实验与病圃实验相结合，设置恒定温度（22、25、28和32 ℃）、自然变温两个处理，检测温度对大丽轮枝菌（）生长、侵染定殖、棉花黄萎病发生的影响；通过调查活性氧（ROS）爆发、过氧化氢（H2O2）含量、胼胝质积累、防御相关基因表达水平等植物防御相关指标，解析温度调控棉花寄主防御反应的机制。【结果】在培养基上，25 ℃是大丽轮枝菌菌丝生长最适温度，22—28 ℃范围内适宜产孢；与培养基相比，不同棉花品种的叶片提取液对大丽轮枝菌生长均有促进作用，感病品种JM11促进作用更强；当温度为25—28 ℃时，ZZM2和JM11植株黄萎病发生均较重，低温22 ℃、高温32 ℃均不利于黄萎病发生。同时，在25 ℃处理下，棉花中大丽轮枝菌侵染定殖能力强，感病品种JM11比抗病品种ZZM2更易受到大丽轮枝菌的侵染，与棉花黄萎病病情指数的结果基本一致；进一步，温度显著影响了棉花寄主防御反应：与22—28 ℃相比，无论是否接种大丽轮枝菌，ZZM2和JM11在32 ℃处理下产生的ROS爆发更强烈；在25 ℃处理下，ZZM2和JM11叶片中H2O2含量最低；在32 ℃处理下，ZZM2和JM11叶片胼胝质积累量较高，分别为817、575个/mm2，是未接菌对照的2.04、1.80倍；棉花叶片中、、防御相关基因在25—28 ℃处理下表达量降低，低于22、32 ℃处理。【结论】温度对大丽轮枝菌生长、寄主防御反应具有双重作用，进而影响棉花黄萎病发生。其中无论恒定温度、自然变温，25—28 ℃均有利于大丽轮枝菌在棉花中侵染定殖，显著降低寄主防御反应，导致棉花黄萎病严重发生。

温度；棉花黄萎病；大丽轮枝菌；防御反应；侵染

0 引言

【研究意义】棉花是一种重要的天然纤维作物，作为战略物资在国民经济中的地位举足轻重[1]。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌（）侵染引起的典型土传维管束病害[2-3]，造成棉花产量和品质严重下降，已成为威胁棉花产业绿色可持续发展的重要因素之一[4]。棉花黄萎病的发生流行取决于病原菌、寄主植物和环境三要素的综合作用，其中温度是最重要的环境因素之一[5-6]。全球温度升高、极端气温波动是未来几十年气候变化的一个重要趋势，可能改变病害的流行区域、消长动态并导致新致病菌株和病原菌的流行[7]。因此，解析不同温度对棉花黄萎病发生的影响以及调控寄主防御反应的机理，揭示温度对病原菌和寄主的双重作用，对该病害的绿色防控和温度调控研究具有重要意义。【前人研究进展】“流行病学三角”概念突出了植物、病原体与环境的相互作用，棉花黄萎病的发生除了与病原菌的致病性、寄主的抗病性有关，还受到环境的影响[8]。气温是限制黄萎病发生流行的主要因素，棉花黄萎病发生最适温度为25—28 ℃，低于22 ℃或高于33 ℃不利于发病，超过35 ℃出现隐症。棉花黄萎病的发生与相对湿度也有一定的关系，当相对湿度55%时，发病株率为65%，相对湿度65%时，发病株率升至70%[9]。当田间环境满足低温、多雨和高湿度3个条件会导致黄萎病严重发生[10-12]。此外，播期和光照对棉花黄萎病发生也有影响[13]。同时，温度变化还会影响植物的防御系统，包括R基因介导的诱导抗性和基础抗性，有研究报道，温度变化可以通过改变R基因的表达水平、R基因介导的信号通路以及R蛋白的稳定性来改变其抗性[14]，基础抗性也可能受到温度变化的影响[15-16]。在拟南芥中，病原菌相关的分子模式flg 22优先诱导基础抗性标记基因和的表达，并在28 ℃处理15 min时激活MAPK，而当温度高于或低于28 ℃时，这些标记基因的激活程度降低[17]，暂时的高温抑制flg 22诱导的活性氧（ROS）积累[18]。最近的一项研究利用水稻与稻瘟病菌（）互作系统，解析了温度调控植物抵抗病原真菌的机制，结果表明，22 ℃时水稻中茉莉酸合成减少，导致寄主基础抗性降低，稻瘟病菌侵染能力增强；而在28 ℃下，稻瘟病菌诱导茉莉酸的合成，并激活茉莉酸信号途径，提高了水稻对稻瘟病的基础抗性水平，抑制稻瘟病发生[19]。在小麦中，含有起始结构域的一种激酶Yr36在35 ℃下对条锈菌（f. sp.）的几个小种具有广谱抗性，但在20 ℃以下则失效[20]。【本研究切入点】全球温度升高、极端气温波动是未来气候变化的一个重要趋势，温度是影响棉花黄萎病发生的关键因素，因此，亟需深入解析温度对病原菌和寄主的双重作用，以便进一步揭示棉花黄萎病发病规律。【拟解决的关键问题】采用室内实验与病圃实验相结合，以棉花抗、感病对照品种为研究对象，系统解析恒定温度和自然变温对大丽轮枝菌侵染、寄主防御反应的影响，揭示温度对病原菌和寄主的双重作用，为有效防治黄萎病和温度调控研究提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试棉花品种为国家棉花品种抗病性鉴定中的典型对照品种：抗病品种中植棉2号（ZZM2）、感病品种冀棉11（JM11），供试黄萎病菌：强致病力菌株Vd080（菌种编号：CGMCC NO. 5904），均由中国农业科学院棉花研究所棉花病害防控团队提供。试验于2022年在中国农业科学院棉花研究所人工接种棉花黄萎病菌病圃（河南安阳）完成。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 温度对大丽轮枝菌生长的影响孢子悬浮液制备：在已活化的Vd080平板上挑取两块菌饼接种于查氏培养基（Czapek）中，于振荡培养箱25 ℃、150 r/mim条件下培养7 d后用四层纱布过滤，得到的滤液借助血球计数板测定孢子浓度，并调整至1×107cfu/mL，备用。

不同抗性棉花叶片提取液制备：称取0.20 g JM11和ZZM2植株叶片，液氮研磨后加入500 μL无菌水，置于10 000 r/min离心3 min，取上清液于0.45 μm滤膜过滤得到叶片提取液，备用。

温度对菌丝生长的影响：分别将200 μL JM11和ZZM2植株叶片提取液均匀涂抹在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上，等量无菌水为对照，用打孔器取6 mm菌落外缘生长旺盛的Vd080菌饼放置于PDA培养基中心处，置于22、25、28、32 ℃的恒温培养箱中培养14 d，每个处理重复3次，利用十字交叉法测定Vd080的菌落直径。

温度对产孢量的影响：吸取1 mL 1×107cfu/mL孢子悬浮液于40 mL Czapek培养基中，分别于培养基中再加入JM11和ZZM2植株叶片提取液400 μL，等量无菌水为对照，置于22、25、28、32 ℃的振荡培养箱中150 r/min培养，每个处理重复3次，于48 h后测定孢子浓度。

1.2.2 恒定温度对棉花黄萎病发生的影响采用蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液法[21]，将营养土、沙子、蛭石按体积比1﹕2﹕3混匀装入无底纸钵（直径6 cm，高度10 cm）中。每钵种植10粒棉花种子，覆土2 cm，以6个无底纸钵为一个处理，每钵定苗5株。在同一温室中培育20 d左右，待第一片真叶平展开时接种Vd080孢子悬浮液（10 mL，浓度1×107cfu/mL），等量Czapek培养液为未接菌对照，每个处理3次重复。接菌后分别放置于恒定温度22、25、28、32 ℃的光照培养箱培育。

于7、21、28 dpi（days post inoculation）调查不同温度下棉花黄萎病的发生情况，计算病情指数。棉花黄萎病病情指数计算公式为Σ[（×）/（×4）]×100。式中，为病情指数，为各级病株数，为病级数值，为调查总株数[22]。

1.2.3 恒定温度对大丽轮枝菌定殖的影响于1、4、7、10、13、16、19 dpi随机选取棉花根部，液氮冷冻后置于-80 ℃冰箱保存。采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN）提取RNA，进一步采用试剂盒TransScript® All-in-One First-Strand cDNA Synthesis Super Mix for qPCR（One-Step gDNA Removal）进行cDNA合成，以棉花为内参，检测基因为大丽轮枝菌，测定棉花根部中大丽轮枝菌的定殖量[23]。采用2-ΔΔCt方法分析处理数据。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.4 温度对棉花防御反应的影响对棉花防御相关基因表达的影响：随机选取棉花叶片提取RNA，将RNA反转录成cDNA，方法同1.2.3所述。通过RT-qPCR测定棉花叶片中防御相关基因苯丙氨酸氨裂合酶基因（phenylalanine ammonia-lyase，）、过氧化物酶基因（peroxidase gene，）、多酚氧化酶基因（polyphenol oxidase gene，）的表达量[24]，采用2-ΔΔCt方法处理数据。引物序列见表1。

对棉花叶片中活性氧爆发的影响：于2 dpi随机选取3叶龄棉花第一片真叶，用无菌水冲洗2—3遍，接着放置于装有5 mL浓度为1 mg·mL-13,3-二氨基联苯胺（DAB）染液的50 mL离心管中，用锡纸包裹，室温避光染色。8 h后轻轻倒掉染料，加入10 mL 95%乙醇于沸水中水浴2 min，脱去部分叶绿素。去除液体后，加入10 mL无水乙醇继续于沸水中水浴，直至叶片中绿色完全褪去。去除液体，并将叶片完全浸没在20 mL 70%的甘油中，以充分赶走细胞间存在的气泡。将叶片平铺放置在载玻片上，采用体视显微镜（Leica M165FC）进行观察[25]。

对棉花叶片中过氧化氢含量的影响：于2 dpi随机选取3叶龄棉花第一片真叶，称取0.10 g棉花叶片，加入1 mL丙酮进行冰浴匀浆，8 000 r/min 4 ℃离心10 min，取全部上清液，采用H2O2含量检测试剂盒（SOLARBIO）测定其含量。

对棉花叶片中胼胝质积累的影响：于2 dpi随机选取3叶龄棉花第一片真叶，用无菌水冲洗2—3遍，放置于50 mL离心管中。配置乙醇﹕乙酸（3﹕1）固定液5 mL加入离心管中，静置2—3 h脱去叶绿素。去除固定液，将叶片置于10 mL 70%乙醇浸泡2 h，去除废液，于10 mL 50%乙醇浸泡2 h，吸干表面水分，加入10 mL无菌水浸泡8 h。去除液体后，加入10% NaOH溶液处理2 h，直至叶片完全透明。用无菌水漂洗叶片2—3次，加入5 mL 0.01%苯胺蓝染液，用锡纸包裹，避光染色4 h。染色结束后于体视显微镜（Leica M165FC）下用紫外光观察胼胝质的积累[26]。

1.2.5 自然变温对棉花黄萎病发生的影响实验地位于中国农业科学院棉花研究所人工接种棉花黄萎病菌病圃（河南安阳），棉花黄萎病发生均匀。于病圃中种植JM11、ZZM2，每个品种种植面积为30 m2，3次重复，详细记录7—8月气温数据。定期调查棉花黄萎病发生情况，计算病情指数。

每隔7 d随机选取棉花植株倒四叶（以棉花植株顶端完全平展的叶子为倒一叶），用液氮冷冻后，置于-80 ℃冰箱保存。采用RT-qPCR测定叶片中大丽轮枝菌的定殖量。

1.3 数据分析

利用软件Microsoft Office Excel 2016对试验数据进行整理计算，利用软件GraphPad Prism 8作图，并采用邓肯新复极差法比较处理之间的差异显著性，Adobe Illustrator 2021进行图形编辑。

2 结果

2.1 温度对大丽轮枝菌生长的影响

2.1.1 对大丽轮枝菌菌丝生长的影响大丽轮枝菌在22—28 ℃范围内均能生长，25 ℃最适宜菌丝生长，32 ℃处理下菌丝不能生长。与对照相比，添加棉花叶片提取液的PDA培养基有利于Vd080菌丝生长，菌落直径较大（图1-A）。在25 ℃处理下，添加ZZM2、JM11叶片提取液的PDA培养基上Vd080的菌落直径分别为5.58、6.16 cm，比对照（4.93 cm）显著增加13%、25%；在28 ℃处理下，添加ZZM2、JM11叶片提取液的PDA培养基上Vd080的菌落直径分别为3.45、4.22 cm，比对照（3.08 cm）增加12%、37%（图1-B）。

2.1.2 对大丽轮枝菌产孢量的影响大丽轮枝菌在22—28 ℃范围内均能产孢，28 ℃最适宜产孢，32 ℃处理下抑制产孢。与对照相比，添加棉花叶片提取液的Czapek培养基有利于Vd080产孢，孢子浓度较大。在28 ℃处理下，添加ZZM2、JM11叶片提取液的Czapek培养基中Vd080的孢子浓度分别为11.31×106、18.02×106cfu/mL，比对照（2.75×106cfu/mL）显著增加311%、555%（图2）。

2.2 恒定温度对棉花黄萎病发生的影响

棉花黄萎病的发生与温度关系明显，当温度为25—28 ℃时，抗病品种ZZM2、感病品种JM11植株出现叶片萎蔫黄化、落叶等发病症状，黄萎病均发生较重，低温22 ℃或高温32 ℃均不利于棉花黄萎病发生（图3-A）。25 ℃处理下，接菌后7 d，ZZM2无明显发病症状，病情指数为0，JM11病情指数为7.69；接菌后28 d，ZZM2的病情指数为23.72，JM11的病情指数为61.22，抗、感品种间黄萎病发生极显著差异。接菌后21 d，22、32 ℃处理下，ZZM2的病情指数分别为3.51、2.88，显著低于25、28 ℃处理下的病情指数。接菌后28 d，28 ℃处理下，JM11的病情指数为51.06，分别是22、32 ℃处理下病情指数的1.84、1.58倍（图3-B）。综上，感病品种JM11比抗病品种ZZM2更早出现发病症状，与低温22 ℃或高温32 ℃相比，ZZM2、JM11在25—28 ℃更易发生黄萎病。

A：不同PDA培养基上Vd080的菌落形态Colony morphology of Vd080 on different PDA media；B：不同PDA培养基上Vd080的菌落直径Colony diameter of Vd080 on different PDA media。不同小写字母表示不同温度间差异显著（P＜0.05）。下同Different lowercase letters indicate significant differences among different temperatures (P＜0.05). The same as below

图2 温度对大丽轮枝菌产孢量的影响

2.3 恒定温度对大丽轮枝菌定殖的影响

温度对大丽轮枝菌在棉花根部定殖的研究结果表明，在不同温度下，ZZM2、JM11中大丽轮枝菌定殖量随时间推移均呈现上升趋势，与病情指数的变化趋势相同。在22—32 ℃范围内，感病品种JM11中Vd080定殖量均高于抗病品种ZZM2中Vd080定殖量（图4）。将大丽轮枝菌侵染棉花的过程大致分为3个阶段，侵染前期（1—4 dpi），在25 ℃处理下，JM11中Vd080定殖量最高，22、28、32 ℃处理下Vd080定殖量无显著差异。侵染中期（7—10 dpi），在25、28 ℃处理下，JM11中Vd080定殖量无显著差异，两者显著高于22 ℃处理下Vd080定殖量。侵染后期（13—19 dpi），在25 ℃处理下，JM11中Vd080定殖量显著高于22、28、32 ℃处理下Vd080定殖量。ZZM2中大丽轮枝菌的侵染发生较晚，在25—28 ℃处理下，ZZM2中Vd080定殖量也高于其他温度处理。综上，随着温度升高，大丽轮枝菌定殖量呈先增加后降低的变化趋势，在25 ℃时定殖量达到最大。

2.4 温度对棉花防御反应的影响

2.4.1 对棉花防御相关基因表达的影响在接菌后1 d，22 ℃处理下，JM11中、表达量分别是25 ℃处理下的3.43、1.28倍；在接菌后4 d，32 ℃处理下，ZZM2中、表达量分别是25 ℃处理下的2.03、1.92倍；在接菌后7 d，25—28 ℃处理下，JM11、ZZM2中表达量显著差异。综上，在不同温度处理下，ZZM2、JM11叶片中防御相关基因表达量存在差异，两品种的基因表达规律基本一致，叶片中、、在25—28 ℃处理下表达量降低，低于22或32 ℃处理（图5）。

2.4.2 对棉花叶片中活性氧（ROS）爆发的影响在22—32 ℃范围内，接种大丽轮枝菌后，JM11、ZZM2叶片中出现ROS爆发，诱导植物防御反应，但抗病品种ZZM2叶片中棕褐色沉积较多，ROS爆发更强烈。与22—28 ℃相比，无论是否接种病原菌，JM11、ZZM2在32 ℃处理下棕褐色沉积颜色更深，沉积点更多，产生的ROS爆发更强烈（图6）。

不同小写字母表示棉花中Vd080定殖量在同一时间的不同处理间差异显著（P＜0.05）Different lowercase letters indicate significant differences in the colonization of Vd080 in cotton at the same time of different treatments (P＜0.05)

图5 温度对棉花防御相关基因表达的影响

2.4.3 对棉花叶片中过氧化氢含量的影响在22—32 ℃范围内，与对照CK相比，接种大丽轮枝菌后，JM11、ZZM2叶片中H2O2含量均提高，但抗病品种ZZM2叶片中H2O2含量高于感病品种JM11。接种大丽轮枝菌后，在32 ℃处理下，JM11、ZZM2叶片中H2O2含量分别为7.67、8.67 μmol·g-1，显著高于25—28 ℃处理；而在25 ℃处理下，JM11、ZZM2叶片中H2O2含量最低（图7）。表明接种大丽轮枝菌后诱导棉花叶片中H2O2含量升高，32 ℃处理下棉花叶片中H2O2含量最高。

2.4.4 对棉花叶片中胼胝质积累的影响在22—32 ℃范围内，与对照CK相比，接种大丽轮枝菌后，JM11、ZZM2叶片胼胝质积累均提高，但抗病品种ZZM2叶片胼胝质积累量高于感病品种JM11。接种大丽轮枝菌后，在32 ℃处理下，JM11、ZZM2叶片胼胝质积累量较高，分别为575、817个/mm2，是对照CK的1.80、2.04倍；而在25 ℃处理下，JM11、ZZM2叶片胼胝质积累量最低，分别为325、400个/mm2，是对照CK的1.70、1.60倍（图8）。表明接种大丽轮枝菌后诱导棉花叶片中胼胝质积累，在22或32 ℃处理下，棉花叶片中胼胝质积累量较高。

A：接种大丽轮枝菌后，不同温度处理下冀棉11叶片中活性氧爆发ROS outbreak in leaves of JM11 under different temperature treatments after inoculation with V. dahliae；B：接种大丽轮枝菌后，不同温度处理下中植棉2号叶片中活性氧爆发ROS outbreak in leaves of ZZM2 under different temperature treatments after inoculation with V. dahliae

图7 温度对棉花叶片中过氧化氢含量的影响

2.5 自然变温对棉花黄萎病发生的影响

根据2022年7、8月气温数据，将气温变化分为5个时期：7月上旬温度变化幅度大，温度最高为30.45 ℃，最低为22.71 ℃；7月中旬及下旬日均温度在25 ℃波动，稳定在22—29 ℃范围内，最高温度不超过35℃，最低温度不低于19 ℃；8月上旬处于相对高温期，日均温度在30 ℃波动，最高可达37.01 ℃，最低温度不低于24 ℃；8月中旬日均温度在28 ℃波动，稳定在24—30 ℃范围内；8月下旬，温度呈现下降趋势，在20 ℃波动。田间自然变温条件下棉花黄萎病的发生情况如图9所示，感病品种JM11出现黄萎病症状较早。结合田间气温变化，在7月中旬及下旬日均温度在25 ℃波动期，JM11黄萎病快速发生，在7月25日，病情指数为40.63，随后呈现快速上升趋势；8月上旬进入日均温度30 ℃的相对高温期后，JM11病情指数的增长幅度有所降低，于8月16日病情指数达到最大值62.39；随后8月下旬的相对低温期，病情指数开始下降。与JM11相比，抗病品种ZZM2出现黄萎病症状较晚且轻，病情指数波动幅度较小，最大值为6.50（8月11日），显著低于JM11，但与JM11病情指数呈现的规律一致，当日均温度在25 ℃时，病情指数上升，遇到日均温度30 ℃左右的高温时，病情指数呈现下降趋势。表明日平均温度25 ℃左右有利于田间黄萎病的发生，而日均温度在30 ℃左右的高温和低于22 ℃的低温则不利于田间黄萎病的发生。

图8 温度对棉花叶片中胼胝质积累的影响

图9 自然变温对棉花黄萎病发生的影响

2.6 自然变温对大丽轮枝菌定殖的影响

为进一步解析田间自然变温对大丽轮枝菌定殖的影响，通过RT-qPCR检测棉花倒四叶中大丽轮枝菌定殖量。结果表明（图10），7月15日以后，JM11中大丽轮枝菌定殖量显著高于ZZM2。结合田间气温变化，在7月中旬及下旬日均温度25 ℃左右的稳定期，JM11叶片中大丽轮枝菌定殖量急剧增加，于7月22日达到峰值0.65；随后定殖量急剧减少，于7月29日降至0.10；8月上旬日均温度30 ℃左右的高温期时，JM11叶片中定殖量开始减少，于8月5日低至0.09；此后温度降至日均温度28 ℃左右时，定殖量开始呈现上升趋势；随后进入低于22 ℃的低温期，JM11中大丽轮枝菌定殖量却仍然在增加，并达到最高值0.92（8月30日）。与JM11相比，ZZM2叶片中大丽轮枝菌定殖量呈现的规律一致，7月22日达到峰值0.09。此外，除个别时间段外，棉花中大丽轮枝菌定殖量与田间黄萎病病情指数的增长呈现相同的变化趋势，表明25 ℃左右有利于田间棉花中大丽轮枝菌定殖。

3 讨论

3.1 温度影响病原菌生长

温度与病原真菌的生长繁殖密切相关，温度不仅影响菌丝的生长，还会影响病原菌的产孢量以及孢子形状、大小等，最终影响病原菌的萌发、侵染和传播[27-28]。此外，不同病原菌甚至同一种病原菌不同小种侵染寄主所需要的适宜温度仍有所不同[29]。本研究结果表明大丽轮枝菌Vd080生长易受到温度影响，25 ℃为最适菌丝生长温度，在22—28 ℃范围内正常产孢。这与前人研究结果基本一致[12,30]。同时，本研究通过棉花叶片提取液模拟棉花的生理环境，测定棉花叶片提取液对大丽轮枝菌生长的影响，结果表明抗病品种ZZM2、感病品种JM11均对大丽轮枝菌的生长具有促进作用，并且在25—28 ℃范围内促进作用更强。然而，袁虹霞等[31]研究表明感病品种的根部分泌物对大丽轮枝菌的菌丝生长与孢子萌发具有促进作用，而抗病品种则具有相反的抑制作用。研究结果的差异可能是由于棉花的根部分泌物与叶片提取液中具有不同的物质导致，也可能是棉花组织液的浓度差异引起。

图10 自然变温对棉花叶片中大丽轮枝菌定殖的影响

3.2 温度影响植物病害发生

温度是病原菌生长、致病等过程中的一个重要环境因子，关于温度过高或过低对病原菌生长和侵染有抑制作用的研究报道较多。温度在12—25 ℃之间波动有利于大豆锈病的发生，但将受感染的植株暴露在37 ℃下1 h后出现隐症[32]；在开花前约15 d，每日高温与小麦赤霉病流行表现出很强的正相关性，但在开花后10 d，这种相关性会变成负相关[33]；Fan等[29]研究表明对于稻曲病菌（），15 ℃的夜间温度可诱导黑粉球和菌核的形成；而对于稻瘟病菌，温度变化会显著影响附着体的形成速度[34]。对于许多真菌病原体来说，适宜温度和高湿度的结合为病害的发生提供了最佳条件[35]；当田间环境满足低温、多雨和高湿度3个条件会导致棉花黄萎病严重发生[10-12]。本研究采用室内实验与病圃实验相结合，系统解析恒定温度和自然变温对棉花黄萎病发生的影响，结果表明棉花黄萎病的发生与温度有很大关系，当温度为25—28 ℃时，无论抗病品种ZZM2、感病品种JM11黄萎病均发生较重，低温22 ℃或高温32 ℃均不利于棉花发病。有报道棉花中黄萎病菌生物量与棉花的抗性呈负相关[36-37]。本研究发现不同温度处理下棉花根部组织中大丽轮枝菌Vd080定殖量在抗、感品种中存在显著差异，在25 ℃处理下，棉花中大丽轮枝菌侵染定殖能力强，感病品种JM11比抗病品种ZZM2更易受大丽轮枝菌侵染，与棉花黄萎病病情指数的结果基本一致。

3.3 温度影响寄主防御反应

温度变化除了影响病原体的致病性外，还影响植物的防御系统，包括R基因介导的抗性和寄主基础抗性[17]。当棉花受到大丽轮枝菌侵染时，会发生一系列的物理和化学变化，产生组织结构抗性和生理生化抗性，如细胞壁加厚、胼胝质和木质素积累、ROS爆发、防御相关基因的表达上调等，很大程度上阻止了病菌的侵染和棉株内扩散[1,4]。然而，温度调节寄主基础抗性的分子机制以及温度波动对棉花基础抗性的影响尚不清楚。张梦婕等[38]研究发现胼胝质积累数量与植株抗虫性呈正相关，在抗虫品种中积累更多；在受到高温或低温处理时，ROS会大量增加，造成氧化胁迫[39]；马晓寒等[40]研究得出在低温处理下烟草幼苗体内的H2O2、O2-等物质含量显著升高，高温处理下也会引起ROS爆发。本研究结果表明不论是否有大丽轮枝菌侵染，棉花在22或32 ℃处理下ROS爆发均比25、28 ℃处理下ROS爆发更强烈，推测棉花植株除了受大丽轮枝菌侵染影响外，还存在22 ℃的低温逆境与32 ℃的高温逆境造成的影响，双重胁迫导致22、32 ℃下棉花植株的防御反应更加强烈。同时，在25 ℃处理下植株的防御相关基因、和相对表达量最小。综上，温度诱导植物基础抗性的下降是大丽轮枝菌能够侵染棉花的重要原因之一。然而，目前对这种环境免疫关系的理解仍处于早期阶段，需要不断揭示温度调节棉花抵抗黄萎病的潜在机制，以便为制定黄萎病防控策略和培育抗病品种以适应全球温度变化提供参考。

4 结论

温度对大丽轮枝菌生长、寄主防御反应具有双重作用，进而影响棉花黄萎病发生。25 ℃是大丽轮枝菌菌丝生长最适温度，22—28 ℃范围内适宜产孢，感病品种JM11叶片提取液对大丽轮枝菌的生长促进作用更强。与低温22 ℃或高温32 ℃相比，25、28 ℃处理下接种大丽轮枝菌后，棉花叶片ROS爆发、H2O2含量、胼胝质积累、防御相关基因的表达等寄主防御反应显著降低。同时，无论恒定温度、自然变温，25—28 ℃均有利于大丽轮枝菌在棉花中侵染定殖，导致棉花黄萎病严重发生。综上，温度诱导植物基础抗性的下降是大丽轮枝菌能够侵染棉花的重要原因之一。

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Effect of Temperature on the Occurrence of Cotton Verticillium Wilt and Host Defense Response

ZHANG YaLin1,2, JIANG Yan2, ZHAO LiHong2, FENG ZiLi2, FENG HongJie2, WEI Feng2, ZHOU JingLong2, ZHU HeQin2, MA ZhiYing1

1College of Agronomy, Hebei Agricultural University/State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation/Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Hebei, Baoding 071000, Hebei;2Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Laboratory of Cotton Bio-breeding and Integrated Utilization, Anyang 455000, Henan

【Objective】The objectiveofthis study is to analyze the effect of different temperatures on the occurrence of cotton Verticillium wilt and the mechanism of regulating host defense response, reveal the dual effects of temperature on pathogen and host, and to provide a theoretical basis for the green control and temperature regulation of this disease.【Method】Cotton Verticillium wilt resistant variety Zhongzhimian 2 (ZZM2) and susceptible variety Jimian 11 (JM11) were employed as experimental materials, indoor experiments and disease nursery experiments were jointly used to set constant temperatures (22, 25, 28, and 32 ℃) and natural temperature variation to determine the effect of temperature on the growth, infection and colonization of, and the occurrence of cotton Verticillium wilt. The mechanism of temperature regulation of cotton host defense response was analyzed by utilizing indicators such as reactive oxygen species (ROS) outbreak, H2O2content, callose accumulation, and the expression of defense-related genes.【Result】On the culture media, 25 ℃ was the optimal temperature for the mycelial growth of, and the range of 22-28 ℃ was suitable for spore yield. Compared with the culture media, the leaf extracts of resistant variety ZZM2 and susceptible variety JM11 had a promoting effect on the growth of, and JM11 promoted stronger. when the temperatures were between 25 and 28 ℃, both ZZM2 and JM11 suffered from severe Verticillium wilt, and low temperature 22 ℃and high temperature 32 ℃ were not conducive to the occurrence of Verticillium wilt. Meanwhile, under 25 ℃treatment, the colonization ability ofin cotton was strong, JM11 was more susceptible toinfection than ZZM2, which was basically consistent with the results of the cotton Verticillium wilt disease index. furthermore, temperature significantly affected the host defense response of cotton: compared with 22-28 ℃, whether inoculated withor not, the ROS outbreak produced by ZZM2 and JM11 under 32 ℃ treatment was stronger; under 25 ℃ treatment, the H2O2content in ZZM2 and JM11 leaves was the lowest; under 32 ℃ treatment, the accumulation of callose in ZZM2 and JM11 leaves was higher, which was 2.04 and 1.80 times higher than that of the untreated control, respectively; the expression level of,, anddefense-related genes in cotton leaves decreased under treatments at 25-28 ℃, which was lower than that under treatments at 22 and 32 ℃.【Conclusion】Temperature has a dual effect on the growth ofand host defense response, which in turn affects the occurrence of cotton Verticillium wilt. Regardless of constant temperature or natural temperature variation, 25-28 ℃ are beneficial for the colonization ofin cotton, significantly reduce the host defense response, and lead to severe cotton Verticillium wilt.

temperature; cotton Verticillium wilt;; defense response; infection