蜡蚧轮枝菌及其在有害生物防治中的应用研究进展

张鹏飞,张昕然,张 龙

(1. 邢台学院,河北省“邢枣仁”利用技术创新中心,河北邢台 054000; 2. 北京嘉景生物科技有限公司,北京100193; 3. 山东省农业科学院植物保护研究所,济南 250100)

病虫害的化学防治引起了食品安全、环境污染等一系列问题,生物防治受到越来越多的重视。蜡蚧轮枝菌Lecanicilliumspp.是一类重要的有害生物生防真菌,其寄主范围极其广泛,除可以寄生半翅目、鳞翅目、鞘翅目、膜翅目、双翅目等昆虫外,还可寄生螨类、线虫以及引起锈病、白粉病、绿霉病的病原真菌等(详见附录增强出版材料)。最早在1861年,Nietner报道了一种寄生锡兰咖啡蜡蚧Lecaniicoffeae的真菌;1898年,Zimmermann将其命名为蜡蚧头孢霉CephalosporiumlecaniiZimm;1939年,Viegas将其并入轮枝孢属VerticilliumNees(Zare and Gams, 2001);2001年,Zare和Gams将该属中对节肢动物、线虫、真菌具有致病性的种类放在新建立的蜡蚧轮枝菌属LecanicilliumW. Gams &Zare中(Zareetal., 2000; Gams and Zare, 2001)。目前,国际菌物系统分类网站(http://www.indexfungorum.org)中共收录蜡蚧轮枝菌属真菌30余种,其中包括研究较多的渐狭蜡蚧菌Lecanicilliumattenuatum、蜡蚧轮枝菌L.lecanii、长孢蜡蚧菌L.longisporum、丝枝蜡蚧菌L.aphanocladii、毒蝇蜡蚧菌L.muscarium、刀孢蜡蚧菌L.psalliotae、蛀虫蜡蚧菌L.cauligalbarum等,而这些种类的蜡蚧轮枝菌在之前被统称为蜡蚧轮枝菌V.lecanii。科学家已经通过自然筛选、遗传改造、基因工程改造等手段获得了许多优良的菌株,并将这些菌株开发成防治粉虱、蓟马、蚜虫和害螨的10余种生物农药(Faria and Wraight, 2007)。蜡蚧轮枝菌分泌的各种降解酶和毒素在作用靶标的过程中也发挥着非常重要的作用,科学家在此领域也开展了许多研究,试图研发新的农药。此外,蜡蚧轮枝菌还可与其他化学农药、昆虫天敌等产品协调应用,从而更有效的防治病虫害。总之,自1861年Nietner报道了蜡蚧轮枝菌后,科学家对其开展了大量的研究,主要集中在致病性、致病机理等方面。尽管已有一些关于蜡蚧轮枝菌研究进展的综述(陈吉棣, 1985; Vinod, 2014),尚罕见对于该菌的致病性进行深入全面总结。本文对蜡蚧轮枝菌的致病性、致病机理、与化学农药的相容性,以及菌株基因工程改良4个方面进行较为全面的综述,希望能够为广大植物保护工作者研究与利用蜡蚧轮枝菌,开展绿色防控提供帮助。

1 蜡蚧轮枝菌致病性

经不完全统计,蜡蚧轮枝菌可以寄生的节肢动物种类至少达46种,其中半翅目21种、双翅目7种、缨翅目4种、鳞翅目4种、鞘翅目2种、直翅目3种、膜翅目2种、螨类3种。有关蜡蚧轮枝菌对蚜虫、蚧壳虫、粉虱、蓟马、害螨等农林生产中重要的小型刺吸式害虫的致病性研究最多,已报道种类至少27种,其中又数蚜虫的种类最多,达10余种,其次为蚧壳虫、粉虱Aleyrodidae、蓟马和害螨。例如,长孢蜡蚧菌和蜡蚧轮枝菌均对柑橘粉蚧具有致病性,都可用于温室柑橘粉蚧的防控,而且对若虫的防效较成虫更好。目前,开发出的蜡蚧轮枝菌商品化制剂也主要针对的是这些小型刺吸式害虫,例如,防治蚜虫的长孢蜡蚧菌农药“Vertalec©”;防治粉虱、蚜虫和害螨的“Verticillin©”;防治粉虱和蓟马的毒蝇蜡蚧菌生物农药“Mycotal©”;防治粉虱和蓟马的“Vertirril©”等(Faria and Wraight, 2007)。这些产品在农业生产中发挥着重要作用。蜡蚧轮枝菌对家蝇Muscadomestica、瓜实蝇Bactroceracucurbitae、棕尾麻别蝇Boettcheriscaperegrina等至少7种蝇类具有致病性。据报道,蜡蚧轮枝菌对橄榄实蝇Bactroceraoleae的致病力高于金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopilae和球孢白僵菌Beauveriabassiana(Mahmoud, 2009)。蜡蚧轮枝菌可在畜牧场中叮咬牛羊的厩螫蝇Stomoxyscalcitrans种群中流行(Skovgrd and Steenberg, 2002)。据报道,蜡蚧轮枝菌对茶树害虫假眼小绿叶蝉Empoascavitis和茶小绿叶蝉E.flavescens、蔬菜害虫菜青虫Pierisrapae、小菜蛾Plutellaxylostella、水稻害虫水稻二化螟Chilosuppressalis、世界性储烟害虫烟草粉斑螟Ephestiaelutella、粮仓重要害虫赤拟谷盗Triboliumcastaneum以及食用菌重要害虫平菇厉眼蕈蚊Lycoriellapleuroti的蛹和幼虫都具有致病性。蝗虫灾害是我国古代三大自然灾害之一,至今依然对全世界的农业生产造成严重危害。Johnson等人通过室内及田间罩笼的方式评价了蜡蚧轮枝菌对双线黑蝗Melanoplusbivittatus、双带黑蝗M.packardii和血黑蝗M.sanguinipes的致病力,结果显示蜡蚧轮枝菌对这3种黑蝗有防效。有些蜡蚧轮枝菌菌株对天敌昆虫桨角蚜小蜂Eretmocerussp.以及茶足柄瘤蚜茧蜂Lysiphlebustestaceipes也有致病性。桨角蚜小蜂在烟粉虱Bemisiatabaci若虫体内产卵6 d后施用毒蝇蜡蚧轮枝菌,致死率随施用孢子浓度的增加而增加,而在产卵12 d后施用蜡蚧轮枝菌,致死率不受影响。蜡蚧轮枝菌在防治褐色橘蚜Toxopteracitricida的同时对其天敌昆虫茶足柄瘤蚜茧蜂的存活也有较重影响。应用浓度为1.49×109个孢子/mL蜡蚧轮枝菌孢子侵染褐色橘蚜12 d后的致死率为78.9%,而用浓度为1.95×109个孢子/mL蜡蚧轮枝菌孢子作用茶足柄瘤蚜茧蜂6 d后的致死率却达到了95.1%。狄斯瓦螨Varroadestructor不仅直接吸食蜜蜂成虫和幼虫的血淋巴,而且可以传播蜜蜂病毒病,是养蜂业中的一种重要害虫。研究表明,浓度为1×108个孢子/mL蜡蚧轮枝菌孢子作用狄斯瓦螨7 d后,致死率可达100%。二斑叶螨Tetranychusurticae是农业生产中的一种重要害螨,有室内生物测定结果表明蜡蚧轮枝菌对二斑叶螨具有致病力,但温室防治试验显示该蜡蚧轮枝菌的防效不高。蜡蚧轮枝菌除了寄生上述节肢动物外,对根结线虫和孢囊线虫均有致病性,刀孢轮枝菌Lecanicilliumpsalliotae分泌的丝氨酸蛋白酶可以降解腐生性的全齿复活线虫Panagrellusredivivus的体壁(Yangetal., 2007)。线虫的卵、幼虫和雌虫是蜡蚧轮枝菌的主要靶标虫态,尤其是卵。刀孢蜡蚧菌对线虫不同时期的卵均有侵染能力,但对处于胚前发育期卵的寄生率明显处于高于胚后发育期的(曹君正等, 2012)。线虫的卵壳从外向内依次为卵黄层、几丁质层和脂质层,其中几丁质层最厚,也最坚固,是防御病原物入侵的重要屏障,蜡蚧轮枝菌分泌的几丁质酶在其穿透线虫卵壳,尤其是几丁质层的过程中具有重要作用(Burgwynetal., 2003)。蜡蚧轮枝菌还可以重寄生引起植物病害的病原真菌。蜡蚧轮枝菌(商品名:Mycotal)可有效抑制温室葫芦上的白粉病,并且发现,助剂矿物油对防治效果有重要影响。蜡蚧轮枝菌对盆栽非洲菊白粉病也有良好的防效,而且过低或过高的孢子浓度均可使防效降低,浓度过低导致致病力不够,而浓度过高又可能对非洲菊的生长产生不良影响(详见附录增强出版材料)。与作用昆虫类似,湿度对于蜡蚧轮枝菌控制真菌病害有重要的影响,在蜡蚧轮枝菌侵染黄瓜白粉病致病真菌单丝壳菌Sphaerothecafuliginea的试验中就观察到了这一现象(Verhaaretal., 1998)。另一项研究表明,在相对湿度95%～100%的条件下,蜡蚧轮枝菌孢子可以成功重寄生引起小麦条锈病的条形柄绣菌Pucciniastriiformis,而当湿度降至85%时,未能观察到任何侵染迹象(Mendgen, 2010)。由此可见,湿度往往是一个重要的限制条件,筛选适应干燥环境的菌株非常有必要。

2 蜡蚧轮枝菌致病机理

蜡蚧轮枝菌对节肢动物的致病过程主要包括分生孢子在寄主体壁附着、萌发并形成侵入钉、菌丝穿透体壁、在血腔形成芽生孢子并萌发形成营养菌丝、菌丝入侵细胞及器官等环节。研究表明,日本龟蜡蚧Ceroplastesjaponicus的口器、足的边缘、肛门及气门周围是最易被蜡蚧轮枝菌孢子入侵的部位。日本龟蜡蚧感染蜡蚧轮枝菌24 h后,孢子成功附着到体壁上,48 h后萌发的菌丝形成侵入钉,72 h后侵入钉穿透体壁进入血腔并形成芽生孢子,92 h后芽生孢子扩散到整个血淋巴中,严重破坏血细胞的同时,对气管、马氏管、肌肉组织等器官也产生严重破坏,144 h后日本龟蜡蚧死亡(Liuetal., 2009)。蜡蚧轮枝菌孢子在菜青虫各龄幼虫体壁上的萌发时间一致,均为12 h,但侵入钉穿透体壁的时间在不同龄期幼虫间存在差异。对于2～3龄的菜青虫幼虫,24 h后即可穿透体壁,而对于4～5龄的幼虫的时间为36 h。侵入虫体的菌丝首先在血腔中生长,然后侵入脂肪体和肌肉,之后中肠、马氏管、丝腺等相继被侵入,最终出现体壁分离、脂肪体变形、溶解、肌纤维排列松散等症状而死亡(Zhangetal., 2003)。庞仁乙等人发现,蜡蚧轮枝菌分生孢子在不同虫态的丝光绿蝇Luciliasericata体表上的附着数量存有显著差异。由于成虫体壁密集着刚毛、鬃等体壁外长物,导致成虫附着的孢子明显多于蛹和幼虫,附着数量可能对致病力具有一定的影响(Pangetal., 2015)。值得关注的是,并非所有蜡蚧轮枝菌都通过穿透体壁侵染。长孢蜡蚧菌孢子在豌豆蚜和柑橘粉蚧体表萌发后,菌丝布满整个虫体,菌丝利用表皮水解产物获取营养,使寄主死亡变僵后,又长出新的分生孢子,整个过程菌丝未穿透体壁(Ghaffarietal., 2017; Zhangetal., 2020。蜡蚧轮枝菌对引起病害的致病真菌的致病过程大致也分为孢子附着、在机械压力和降解酶的共同作用下穿透寄主细胞、在寄主细胞内生长使其崩解等步骤。对引起黄瓜白粉病的单丝壳菌Sphaerothecafuliginea致病机理研究表明,蜡蚧轮枝菌首先通过分泌粘液,使孢子紧紧附着到寄主菌丝上,24 h后可明显观察到寄主细胞发生空泡化以及解体现象,36 h后细胞膜收缩,细胞质聚集,48 h后,细胞壁严重变形扭曲,细胞严重解体,72 h后,寄主细胞彻底崩解,细胞质被消耗殆尽,周围空间被蜡蚧轮枝菌占据(Askaryetal., 1997)。蜡蚧轮枝菌侵染线虫卵的机理大致与上述侵染昆虫和病原真菌类似。首先菌丝吸附到线虫卵壳上形成附着胞和侵染钉,之后侵染钉通过机械压力以及分泌降解酶的共同作用穿透卵壳,最终导致卵因失水而丧失活性(Moosavietal., 2011)。

图1 蜡蚧轮枝菌对日本龟蜡蚧Ceroplastes japonicus和温室白粉虱Trialeurodes vaporariorum的致病性以及对柑橘绿霉病的抑制作用Fig.1 Pathogenicity of Lecanicillium against Ceroplastes japonicus and Trialeurodes vaporariorumand its inhibitory effect against green mold of citrus注:A,感染蜡蚧轮枝菌的日本龟蜡蚧体表长出了白色的菌丝(Liu et al., 2009);B,感染蜡蚧轮枝菌的温室白粉虱体表长出了白色的菌丝;C～D,蜡蚧轮枝菌对引起柑橘绿霉病的指状青霉菌Penicillium digitatum的抑制作用(Benhamou, 2004)。图C为单接种指状青霉菌的对照,柑橘果实表面长满了指状青霉菌的白色菌丝,其中上半部分的白色菌丝长满了灰绿色的孢子(箭头所示),呈现出绿霉病的典型症状;图D为共同接种指状青霉菌和蜡蚧轮枝菌的果实,由于指状青霉菌受到蜡蚧轮枝菌的抑制,只在接种处的局部区域长出了指状青霉菌白色菌丝。Note: A, Ceroplastes japonicus died from Lecanicillium spp. showing white hyphal growth (Liu et al., 2009); B, Trialeurodes vaporariorum died from Lecanicillium spp. showing white hyphal growth; C～D, Inhibitory effect of Lecanicillium spp. against Penicillium digitatum which caused green mold of citrus (Benhamou, 2004). The citrus inoculated only with P.digitatum was covered with white hyphal (the bottom half) and grey-green spores (the top half), showing typical symptoms of green mold(C). White hyphal of P.digitatum only grew from inoculation area of citrus inoculated with both of P.digitatum and Lecanicillium spp., showing the inhibitory effect of Lecanicillium spp. against P.digitatum (D).

致病真菌分泌的降解酶在其侵入寄主体壁的过程中发挥了重要作用。现已明确昆虫致病真菌、线虫致病真菌和植物病原菌的重寄生真菌分泌的几丁质酶是一类非常重要的降解酶(Kobayashietal., 2002; Charnley, 2003)。几丁质是一类具有长链β-1, 4-N-乙酰葡萄糖胺的高分子生物多聚体,存在于昆虫体壁、线虫卵壳以及植物病原真菌的细胞壁中(Bartnicki-Garcia, 1968; Wharton, 1980; Merzendorfer and Zimoch, 2013)。几丁质酶可催化水解几丁质的β-1,4糖苷键生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)(Shaikh and Deshpande, 1993),是降解几丁质的关键酶类。有关蜡蚧轮枝菌几丁质酶的研究也有一些报道。例如,番茄经白粉虱刺激后所产生的挥发物可以促进蜡蚧轮枝菌几丁质酶基因的表达,从而提高了蜡蚧轮枝菌对白粉虱的毒性(Linetal., 2021);从蜡蚧轮枝菌中分离纯化的几丁质酶对植物病原菌串珠镰刀菌Fusariummoniliforme的孢子萌发具有抑制作用(Gangetal., 2015);从渐狭蜡蚧菌中分离纯化的几丁质酶对南方根结线虫Meloidogyneincognita的卵具有破坏作用(Nguyenetal., 2007);从刀孢轮枝菌克隆到的几丁质酶基因Lpchil,经毕赤酵母PichiapastorisGS115系统表达得到的几丁质酶可以降解南方根结线虫的卵壳,同时对卵的发育具有抑制作用(Ganetal., 2007)。还有研究表明,不同的培养基成分对蜡蚧轮枝菌降解酶的活性具有重要影响。余德亿等人研究表明,与明胶、几丁质等成分相比,在培养基中添加榕母管蓟马Gynaikothripsflcorum、菜缢管蚜Lipaphiserysimi和烟粉虱的虫尸粉可以显著提高蜡蚧轮枝菌降解酶的活性,同时显著提高了菌株对榕母管蓟马若虫和成虫的毒力(余德亿等, 2016)。还有研究表明,在蜡蚧轮枝菌培养基中添加蝉蜕和烟粉虱的虫尸粉连续培养5代后,与常规培养基相比,蜡蚧轮枝菌的降解酶活性以及对烟粉虱的毒力均显著提高(景亮亮等, 2020)。

昆虫致病真菌一般存在毒力弱、不易储藏、对田间环境适应性差等问题,使其广泛应用受到了限制。然而,昆虫致病真菌在侵入虫体后分泌的毒素往往比较稳定,是一类很有潜力的天然杀虫产物。科研人员先后从绿僵菌、白僵菌、莱氏野村菌Nomuraea、曲霉Aspergillus、拟青霉Paecilomyces、轮枝菌、多毛菌Pestalotiopsis等属的真菌菌丝及培养基中分离出破坏素(Destruxin)、白僵菌素(Beauvercin)等一系列毒素(蒲蛰龙和李增智, 1996)。自1978年日本学者Kanaoka首次报道了一类对家蚕具有毒杀作用的环状缩羧肽类蜡蚧轮枝菌毒素后,许多研究报道蜡蚧轮枝菌可以产生毒素(Kanaokaetal., 1978)。现已证实,蜡蚧轮枝菌粗提液对各个虫态的烟粉虱、白粉虱、桃蚜、菜粉蝶Pierisrapae5龄幼虫、棉铃虫Helicoverpaarmigera、叶蝉Empoascakerri、大豆胞囊线虫Heteroderaglycines等多种害虫均具有毒力(Gindinetal., 1994; 王克勤等, 2000; 宋肖玲和李国霞, 2005; Sharma and Vyas, 2008; Shinyaetal., 2008; 纪明山等, 2010; Wangetal., 2010; 洪慧金等, 2011)。此外还发现,蜡蚧轮枝菌粗提液对天敌昆虫小黑瓢虫Delphastuscatalinae的幼虫也具有毒力,需要在开发过程中注意对天敌的杀伤作用(Wangetal., 2005)。目前已经明确的蜡蚧轮枝菌毒素主要包括啶羧酸类、环状缩羧肽类、磷脂酸类似物以及蛋白类共4类。Claydo等人从蜡蚧轮枝菌次生代谢产物中提取出一类对丽蝇Calliphoraerythrocephala具有杀虫活性的吡啶二羧酸物质(Claydon and Grove, 1982);Wang等人报道了一种对烟粉虱具有较强毒性的环状缩羧肽类蜡蚧轮枝菌毒素(Wangetal., 2010);Soman等人从蜡蚧轮枝菌代谢产物中分离出了一种对棉铃虫具有杀虫活性的磷脂酸类似物(Somanetal., 2001)。有关蜡蚧轮枝菌蛋白类毒素有一些相对较为深入的研究。Abdul等人用从蜡蚧轮枝菌代谢物中提取的蛋白处理番茄后再饲喂桃蚜,发现桃蚜的存活率及繁殖力均受到较明显的抑制。进一步研究发现,番茄经此毒蛋白处理后,其抗虫基因的表达水平明显上调,而且这些上调的基因均为植物典型的水杨酸抗虫途径和茉莉酸抗虫途径中的关键基因(Abduletal., 2020)。

3 蜡蚧轮枝菌与农药的相容性及协调应用

协调应用化学农药与昆虫病原真菌防治病虫害可减少化学农药的施药次数及用量(Pamela, 2019)。由于化学农药对昆虫病原真菌的生长具有不同程度的抑制作用,因此,明确二者的相容性是复配应用的必要前提(Sainetal., 2019)。自从英国的Hall在20世纪80年代测试了20种农药与蜡蚧轮枝菌的相容性后,科学家在该领域开展了大量研究(Hall, 1981)。大部分化学农药都对蜡蚧轮枝菌具有不同程度的抑制作用。与杀虫剂相比,作为真菌的蜡蚧轮枝菌与杀菌剂的相容性更差。一些特殊类型的农药有时与蜡蚧轮枝菌可以很好的相容。研究发现,丙环唑、代森锰锌等6种杀菌剂以及吡虫啉、噻嗪酮等4种杀虫剂对蜡蚧轮枝菌的抑制作用均很强(Cuthbertsonetal., 2005; Alietal., 2012),而防治番茄灰霉病的一种微座孢属真菌以及防治白粉病的一种植物提取物与蜡蚧轮枝菌具有很好的相容性(Bardinetal., 2008)。蜡蚧轮枝菌与防治烟粉虱的一种海藻酸(商品名:Agri-50E)和一种螺甲螨酯(商品名:Oberon)的相容性很好,而与防治烟粉虱的一种植物提取物(商品名:Majestik)、矿物油以及一种脂肪酸的相容性却较差(Cuthbertsonetal., 2008)。相容性不仅受化学农药种类的影响,而且与助剂、菌株也有较大关系(Andersonetal., 1989)。在翟晓曼等人的研究中,吡虫啉对蜡蚧轮枝菌孢子萌发的抑制率高于谷祖敏等人的结果,可能原因在于与普通吡虫啉制剂相比,翟晓曼等人所用的高渗吡虫啉制剂含有高渗助剂,有助于农药渗入真菌体内而使抑制作用增强(谷祖敏等, 2006; 翟晓曼等, 2013)。

值得注意的是,在实际生产应用时,可以采用先喷施化学农药再喷施蜡蚧轮枝菌的这一间接的方式复配,往往即不影响协调应用的效果,又可以解决相容性问题。上述与蜡蚧轮枝菌相容性很差的吡虫啉、噻嗪酮、矿物油等,与蜡蚧轮枝菌采用先后喷施的协调应用方式成功解决了相容与复配之间的矛盾(Cuthbertsonetal., 2005; Cuthbertsonetal., 2008)。针对这一现象的机理也有一些研究。研究发现,用吡虫啉农药处理过的榕管蓟马Gynaikothripsuzeli对蜡蚧轮枝菌的抗性减弱,使得后续喷施的蜡蚧轮枝菌的效果增强,这主要由于经吡虫啉处理的榕管蓟马对蜡蚧轮枝菌的酚氧化酶途径相关的免疫能力下降所致(Linetal., 2018)。蜡蚧轮枝菌还是部分植物的内生真菌,部分植物内寄生蜡蚧轮枝菌后对蚜虫的抗性增强,这种增强的抗性可能直接来自蜡蚧轮枝菌,也可能来自菌与植物间互作产生的代谢物(Andersonetal., 2007)。研究表明,当用接种了蜡蚧轮枝菌的棉花叶片饲喂棉蚜AphisgossypiiGlover,棉蚜的繁殖力明显下降(Gurulingappaetal., 2010)。蜡蚧轮枝菌与部分植物间的内寄生关系,为其与化学农药的复配提供了新的思路。研究表明,当用噻虫嗪、丁醚脲、硫丹等9种农药与蜡蚧轮枝菌直接复配,均产生了不同程度的抑制作用,硫丹甚至产生了完全的抑制作用,但当先用蜡蚧轮枝菌寄生棉花,再向棉花喷施这 9种农药,未发现任何抑制作用(Gurulingappaetal., 2011)。

有关蜡蚧轮枝菌与生物农药的协调应用也有一些报道。研究表明,蜡蚧轮枝菌与印楝素、苦参碱混配防治大豆蚜Aphisglycines均具有明显的协同增效作用,其中与印楝素混配增效更明显,处理7 d后的田间防效可达89.47%(莽逸伦等, 2006)。植物源杀虫剂椰树皂(商品名:Palizin)、胡椒提取物(商品名:Tondexir)以及蜡蚧轮枝菌均可用于防治危害蜜蜂的大蜡螟Galleriamellonella。据报道,先用亚致死剂量的Palizin或Tondexir作用大蜡螟24 h,再施用蜡蚧轮枝菌孢子悬浮液,发现Palizin处理过的大蜡螟对蜡蚧轮枝菌的敏感性受到了抑制,而Tondexir作用过的大蜡螟不受影响(Faribaetal., 2019)。微座孢属生防真菌Microdochiumdimerum、一种虎杖Reynoutriasachalinensis提取物(商品名:Milsana)和蜡蚧轮枝菌(商品名:Mycotal)可分别用于控制温室番茄的三大病虫害:灰霉病、白粉病和粉虱。为了实现对这3种病虫害的统防统治,对这3种制剂的联合防效进行了评价,结果显示,混合应用对各制剂的防效无抑制作用,互不影响,可以混用进行统防统治(Bardinetal., 2008)。适宜的助剂亦可增加蜡蚧轮枝菌的药效。纳米缓释剂可通过延长农药的持效期、提高农药的分散性和渗透性等增强药效。据报道,蜡蚧轮枝菌与纳米网构控失剂SC108、纳米活性炭混合使用可显著提高其对桃蚜和西花蓟马的防效,但对烟粉虱的增效作用不明显(张红艳等, 2020)。有关蜡蚧轮枝菌与天敌昆虫的协调应用也有一些报道。将携带蜡蚧轮枝菌孢子的一种小花蝽属的捕食性天敌Oriuslaevigatus释放到青椒上防治桃蚜,5 d后98%的桃蚜感染了蜡蚧轮枝菌,防治效果显著高于单释放小花蝽以及单喷施蜡蚧轮枝菌(Downetal., 2009)。郑珊珊等人联合施用蜡蚧轮枝菌孢子悬液和天敌昆虫缨小蜂Schizophragmaparvulas防治假眼小绿叶蝉的效果显著好于单独施用这两种生物农药(郑珊珊等, 2012)。相反,有的蜡蚧轮枝菌对天敌昆虫,如茶足柄瘤蚜茧蜂和桨角蚜小蜂具有杀伤作用。与喷施了蜡蚧轮枝菌的温室白粉虱若虫相比,天敌昆虫丽蚜小蜂Encarsiaformosa更青睐寄生喷施了吐温-80的对照温室白粉虱若虫(Fazeli-Dinanetal., 2016)。Aqueel等人发现,先用蜡蚧轮枝菌感染小麦上的禾谷缢管蚜Rhopalosiphumpadi和麦长管蚜Sitobionavenae,并不影响蚜茧蜂Aphidiuscolemani对这两种蚜虫的寄生,然而,先用蚜茧蜂寄生这两种蚜虫后再用蜡蚧轮枝菌感染,发现蚜茧蜂寄生过的这两种蚜虫的蜡蚧轮枝菌感染率显著低于未寄生过的对照蚜虫。Aqueel等人还证实了异色瓢虫Harmoniaaxyridis也存在上述现象。异色瓢虫取食被蜡蚧轮枝菌感染了72 h的上述两种蚜虫的数量显著低于取食未经感染的对照蚜虫(Aqueel and Leather, 2013)。

4 菌株的基因工程改良

蜡蚧轮枝菌的基因工程改造主要包括原生质体融合、诱变和转基因3种方式。真菌的原生质体融合技术是指把两个具备不同优良性状的亲本菌株利用酶解法去除细胞壁获得仅由细胞膜包裹的球状原生质体,然后采用物理方法(如电融合)、化学方法(如聚乙二醇)或生物方法(如病毒)使细胞相互接触,逐步发生膜融合、胞质融合以及核融合,进而发生基因重组,在适当的条件下融合子再生即获得杂交菌株。Aiuchi等人将数十种蜡蚧轮枝菌进行原生质体融合,最终筛选出13株既耐干旱,同时又对棉蚜和粉虱具有高致病力的杂合菌株(Aiuchietal., 2007)。Shinya等人利用原生质体融合技术针对大豆孢囊线虫Heteroderaglycines筛选优良菌株,发现由毒蝇蜡蚧菌与长孢蜡蚧菌融合的AaF42菌株对线虫卵的致死率高出空白对照93%,同时还发现,AaF42融合菌株培养基滤液对线虫的卵和2龄幼虫都具有明显的抑制作用(Shinyaetal., 2008a; 2008b)。Xie等人研究了通过紫外诱变和化学诱变改变蜡蚧轮枝菌对杀菌剂霜霉威的抗性问题。紫外诱变结果表明,经过6轮诱变,菌落高度变矮,但产孢量以及对蚜虫的致病性未受影响,但对霜霉威产生了明显的抗性(Xieetal., 2018);化学诱变结果表明渐狭蜡蚧菌经N-甲基-N"-硝基-N-亚硝基胍诱导发生突变后对霜霉威的抗性最高提高了2.79倍,产孢量、菌落的生长情况以及对线虫卵的致病力均无显著变化(Xieetal., 2016)。通过转基因的方式可以将优良基因直接转入目标菌株。Zhang等人利用聚乙二醇介导的原生质体转化体系将白僵菌的表皮降解蛋白酶基因Cdep1转入蜡蚧轮枝菌后,新菌株的蛋白酶活性提高了5倍,对棉蚜的致死中浓度(LC50)降低了2倍,致死中时间(LT50)减少了14.2%,在虫体内的生长速度明显加快,而在培养基上的产孢量无差异(Zhangetal., 2016)。同样,Xie等人将白僵菌表皮降解蛋白酶Cdep1基因转入渐狭蜡蚧菌后,新菌株蛋白酶的活性不仅增加了2～3倍,而且酶活性出现的时间也提前了。进一步研究表明,用这一新改造的渐狭蜡蚧菌培养基滤液处理大豆包囊线虫,发现对卵的孵化以及2龄幼虫的活动能力均表现出明显的抑制作用(Xieetal., 2016)。科学家还将东亚钳蝎Buthusmartensi的蝎毒素基因BmKit转入蜡蚧轮枝菌中,获得的新菌株比野生型菌株对棉蚜的致死中浓度降低了7.1倍,致死中时间减少了26.5%(Zhaoetal., 2015)。毒蝇蜡蚧菌转入漏斗网蛛毒素基因后,可以成功分泌重组蛋白,但对寄主的致病力是否提高尚未研究(Sergeyetal., 2019)。科研人员还借助RNA干扰技术成功获得了一株高效蜡蚧轮枝菌菌株,首先针对寄主柑橘粉虱Dialeurodescitri(Ashmead)免疫系统的溶菌酶基因(DcLZM)、酚氧化酶原免疫基因(DcPPO)以及酚氧化酶原激活因子基因(DcPPO-AF)3个重要的免疫基因设计双链RNA(dsRNA),并构建dsRNA表达载体,然后转入渐狭蜡蚧菌中进行表达,使得侵入柑橘粉虱的渐狭蜡蚧菌表达dsRNA,致使柑橘粉虱的上述免疫基因发生沉默,免疫力下降,进而增加了渐狭蜡蚧菌的致病力。最终的生测结果显示,转基因菌株的致病力是野生型对照的3倍(Yuetal., 2018)。

5 问题与展望

蜡蚧轮枝菌寄主谱相当广,既可以侵染害虫又可以防治植物病害,这为进一步深入研究开发出病虫兼治的微生物农药奠定了基础。然而,尽管已有很多关于蜡蚧轮枝菌的研究报道,但是只有极少菌种(株)被开发出了能够大规模应用的商品。研究表明,难以大规模生产分生孢子的生物学特性、致病力弱和对环境抗逆性差是重要的限制因素。因此今后还需要从上述几个方面开展深入研究,以便开发出更多防治效果更好的微生物农药。利用基因工程技术为开发出适于大规模生产蜡蚧轮枝菌分生孢子、提高其致病力和抗逆性方面提供了可能。

实现蜡蚧轮枝菌有毒代谢产物的商品化生产依然具有很大的挑战性。真菌毒素一般为多种次生代谢产物的混合物,而且每种化合物的合成时间以及在昆虫致死过程中发挥作用的时间也各不相同。例如研究较为透彻的罗伯茨绿僵菌M.roberts侵入寄主体内后合成的破坏素是一类包括至少16种相类似的化合物的混合物,而且这些破坏素的天然合成时间又不相同,这将给人工合成以及实际应用带来很大的困难(Wangetal., 2012)。当然也可以通过繁殖真菌来合成毒素,但这些毒素混合物中往往夹杂有其他的成分,规模化的分离和纯化也将具有一定的挑战性(亓兰达等, 2020)。