那他霉素关键杂质的制备及其结构鉴定
2023-12-26李晓露曹鹏然高月麒张雪霞王宁任风芝于兰
李晓露?曹鹏然?高月麒?张雪霞?王宁 任风芝 于兰
摘要:目的 分离纯化那他霉素关键工艺杂质,并鉴定其结构,为那他霉素工艺和质量控制奠定基础。方法 采用色谱纯化技术,分离制备那他霉素粗品中的关键杂质,经LC-MS和NMR分析鉴定杂质结构。结果 建立了那他霉素工艺杂质的分离纯化方法,制备得到了3个杂质化合物,并通过波谱分析鉴定了化合物结构,其中杂质1为那他霉素的C2位差向异构体;杂质2为那他霉素的C18位甲氧基取代产物;杂质3为那他霉素三元氧环开环后脱去羟基形成的双键产物。结论 杂质化合物与那他霉素具有相似的骨架结构,均由那他霉素生产过程产生,为那他霉素原料药的生产工艺开发和质量控制提供了技术参考。
关键词:那他霉素;杂质;分离纯化;结构鉴定
中图分类号:R978.1文献标志码:A
Preparation and structure identification of the key impurities of natamycin
Li Xiaolu, Cao Pengran, Gao Yueqi, Zhang Xuexia,Wang Ning, Ren Fengzhi, and Yu Lan
(National Engineering Research Center of Microbial Medicine, Hebei Industry Microbial Metabolic Technology Innovation Centre, New Drug Research & Development Company of NCPC, Shijiazhuang 052165)
Abstract Objective To isolate and purify the key process impurities of natamycin, and to identify their structures, so as to lay a foundation for the process and quality control of natamycin. Methods The key impurities in the natamycin crude product were separated and prepared by chromatographic purification technology, and their structures were identified by LC-MS and NMR analysis. Results A method was established for separation and purification of the process impurities of natamycin. Three impurities were prepared, and their structures were identified by spectral analysis. Among them, Impurity 1 was the C2 epimer of natamycin; Impurity 2 was the C18 methoxy substituent of natamycin; Impurity 3 was the double bond product formed by removing the hydroxyl group after the ring opening of the epoxy three-membered of natamycin. Conclusion These impurity compounds have similar skeleton structure with natamycin, which are produced in the production process of natamycin. This study provides a technical reference for the production process development and quality control of natamycin API.
Key words Natamycin; Impurity; Separation and purification; Structural identification
那他霉素是一種多烯大环内酯类抗生素,不仅能有效抑制霉菌和酵母菌的生长,还能抑制真菌毒素的产生,在食品保鲜和抗真菌治疗方面均有很好的应用[1-5]。那他霉素滴眼液由美国Alcon公司研发,1978年在美国上市,商品名为Natacyn?(那特真)。由于其显著的抑菌和杀菌作用,那他霉素被专家推荐为一线眼部抗真菌药物,其抗菌机制为同真菌细胞膜上的固醇相结合,转化为多烯固醇复合物,通过改变细胞膜内外渗透压导致细胞内容物外溢,造成真菌细胞死亡[6]。由于那他霉素良好的治疗效果,它通常也是大多数真菌性角膜炎和角膜溃疡患者的首选抗生素。
那他霉素来源于微生物发酵,虽然发酵过程主要产生那他霉素,但也会产生许多那他霉素的结构类似物和其他发酵副产物。那他霉素含有碱性和酸性基团(图1),可溶于冰醋酸,微溶于甲醇,几乎不溶于乙醇和水[7]。
杂质研究是药物开发的重要组成部分,不仅可为原料药及制剂的工艺质量控制提供依据,也有助于提高产品质量标准的可靠性。本文建立了那他霉素关键工艺杂质的分离提纯方法,制备得到了杂质单体,并鉴定了杂质结构,这对那他霉素相关物质的控制和药物安全性的保证具有重要意义。
1 仪器与试药
LC-2030C 3D型高效液相色谱仪(日本岛津公司);LC3000型制备液相色谱仪(北京创新通恒科技有限公司);TR026型酸度计(Mettler公司);Loborata 4000型旋转蒸发器(Heidolph公司);AS-LGJ-18A型冷冻干燥机(郑州安晟科学仪器有限公司);Xevo TQ质谱仪(Waters公司);Avance III 500型核磁共振波谱仪(Bruker公司)。
那他霉素粗品(色谱纯度86.3%)本公司自制;UniSil C18购自苏州纳微科技股份有限公司;色谱纯乙腈、甲醇、氘代二甲基亚砜购自美国Merck公司;其他试剂购自天津市科密欧化学试剂有限公司。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
参照《中国药典》2020年版方法[7],进行那他霉素HPLC检测,色谱柱:Diamonsil C18 (4.6 mm×250 mm,
5 μm);以乙酸铵缓冲液-乙腈-四氢呋喃(76:24:0.5)为流动相;流速1.0 mL/min;检测波长303 nm。那他霉素粗品的HPLC图谱见图2。
2.2 杂质富集
称取那他霉素粗品15 g,加入120 mL甲醇,用2 mol/L盐酸调pH至3.7~4.2使之溶解,溶解液经0.45 μm滤膜过滤,得到澄清上样液。
2 L层析柱(反相硅胶C18填料,10 μm),流动相为37%乙腈-63%水(含0.2%乙酸铵),流速为70 mL/min,检测波长303 nm,平衡1倍柱体积后上样,采用同样条件进行洗脱,根据在线图谱分别进行主峰前杂质和主峰后杂质的收集,收集的洗脱液减压浓缩后待再次纯化。
2.3 杂质单体制备
2.3.1 主峰前杂质的分离制备
制备柱(Kromasil C18,100-10-C18,21.2 mm ×250 mm),流动相为27%乙腈-73%水(含0.2%乙酸铵),流速为14 mL/min,检测波长303 nm。
平衡制备柱2倍柱体积后,取“2.2”项所得主峰前杂质进样,根据在线检测图谱进行杂质馏分收集。合并HPLC纯度大于95%的杂质1馏分,经减压浓缩后冻干,得到杂质1: 60 mg,色谱纯度98.2%。
2.3.2 主峰后杂质的分离制备
制备柱(Kromasil C18,100-10-C18,21.2 mm ×250 mm),流动相为32%乙腈-68%水(含0.2%乙酸铵),流速为14 mL/min,检测波长303 nm。
平衡制备柱2倍柱体积后,取“2.2”项所得主峰后杂质进样,根据在線检测图谱进行馏分收集。分别合并HPLC纯度大于95%的杂质2馏分和杂质3馏分,经减压浓缩后冻干,得到杂质2:32 mg,色谱纯度95.3%;杂质3: 26 mg,色谱纯度96.7%。
2.4 杂质结构鉴定
2.4.1 质谱分析
将那他霉素杂质化合物用甲醇溶解,进行质谱分析,其ESI(+)分析结果见图3。
2.4.2 核磁共振分析
将那他霉素杂质化合物用氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)溶解,进行核磁共振波谱分析,其1H NMR和13C NMR数据见表1~2。
2.4.3 结构解析[6]
杂质1:由ESI(+)离子峰图谱可知,杂质1分子量为665,与那他霉素的分子量相同。由NMR数据可知杂质1与那他霉素C、H的个数相同,因此确定杂质1的分子式与那他霉素相同。比对杂质1与那他霉素的NMR数据,可以发现二者数据基本一致,仅C-3(ΔδC 6.6)化学位移有明显差别,结合NOESY谱中1-Me与H-4有NOE相关,即杂质1的1-Me朝向与那他霉素相反,可以判断杂质1为那他霉素的C2位差向异构体。
杂质2:由ESI(+)离子峰图谱可知,杂质2分子量为679,比那他霉素的分子量多14。由核磁共振波谱数据可知,杂质2含有一个连氧甲基,该甲氧基δC 47.39 ppm,δH 2.97 ppm, s, 结合HMBC,可以发现该甲氧基的氢信号与C18相关。综合分析HSQC、HMBC、H-H COSY及NOESY,对杂质2的碳信号和氢信号进行了归属,可以判断杂质2为那他霉素的C18位甲氧基取代产物。
杂质3:由ESI(+)离子峰图谱可知,杂质3分子量为649,比那他霉素的分子量少16。由NMR数据可知杂质3较那他霉素少一个O。比对杂质3与那他霉素的NMR数据,可以发现二者数据基本一致,差异主要为C-22和C-23的化学位移,根据存在差异的H谱裂分情况、C谱的化学位移变化、HSQC以及H-H COSY的相关,可以判断杂质3是那他霉素三元氧环开环后脱去羟基形成的双键产物。
杂质1~3的结构式见图4。
3 讨论
那他霉素是纳塔尔链霉菌或褐黄孢链霉菌等微生物的次级代谢产物,从发酵液中提取纯化后获得,工艺杂质的研究及控制对于产品质量控制尤为重要。本研究应用制备色谱纯化技术,探索了那他霉素粗品中关键杂质的分离提纯方法,并通过质谱和核磁共振波谱等分析手段,确定了杂质的结构,其中杂质1为那他霉素的C2位差向异构体;杂质2为那他霉素的C18位甲氧基取代产物;杂质3为那他霉素三元氧环开环后脱去羟基形成的双键产物。经检索,3个杂质未见文献报道,为首次分离鉴定。
在进行那他霉素杂质流程研究时发现,杂质1~3均为那他霉素发酵代谢产物。其中,杂质2和3在提取精制过程中,所占比例逐渐降低,成品中占比均小于0.1%,对产品质量影响较低。杂质1在粗提过程中占比有波动,碱溶酸沉步骤略有增长,且对pH比较敏感,精制结晶过程可有效去除,成品中未检出。因此,在那他霉素发酵及提取过程中,避免高pH条件,可减少杂质1的生成。该研究为更加精准控制那他霉素产品质量和指导生产工艺优化提供了可靠的依据。
参 考 文 献
Welscher Y M, Napel H H, Balague M M, et al. Natamycin blocks fungal growth by binding specififically to ergosterol without permeabilizing the membrane[J]. J Biol Chem, 2008, 283(10): 6393-6401.
Ture H, Eroglu E, Ozen B, et al. Effect of biopolymers containing natamycin against Aspergillus niger and Penicillium roquefortii on fresh kashar cheese[J]. Int J Food Sci Technol, 2011, 46(1): 154-160.
王冬梅, 陈光胜, 黄明汉. 那他霉素在真菌性角膜溃疡愈合中的治疗作用[J]. 国际眼科杂志, 2010, 10(4) :744-745.
忻丹丽, 沈降, 潘飞. 那他霉素联合伊曲康唑治疗真菌性角膜炎的疗效分析[J]. 中国现代医学杂志, 2017, 27(20): 73-75.
郑振扬, 叶忠强. 那他霉素联合伏立康唑治疗真菌性角膜炎的疗效分析[J]. 中国实用医药, 2020, 15(30):155-157.
梁景乐. 纳他霉素高产菌株空间育种、工艺优化及工业放大研究[D]. 浙江大学博士学位论文, 2007.
国家药典委员会. 中华人民共和国药典[S]. (2020年版第二部). 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 498-499.
收稿日期:2022-12-28
基金项目:河北省科技研发平台建设专项(No. 22567651H)
作者简介:李晓露,女,生于1974年,硕士,正高级工程师,主要从事微生物药物分离纯化,E-mail: luncpc@163.com
*通信作者, E-mail: yulan2680@163.com