PF1022A产生菌的菌种选育及培养基优化

项仁鑫?孙鹏?杨小虎?潘玲玲?方佳双?应灵萍?徐倩

摘要：目的 筛选PF1022A高产菌株，并优化发酵条件，以提高发酵水平。方法 以PF1022A产生菌座坚壳菌（Rosellinia sp.）HS-NF-1412Z（3050 mg/L）为出发菌株，采用紫外诱变育种，再在单因素试验的基础上结合Box-behnken（BB）响应面法优化发酵条件。 结果 获得一株产PF1022A的高产稳定菌株HS-NF5-86-5-88，发酵水平较出发菌株提高了19%。采用优化后的发酵培养基：麦芽糊精163.0 g/L，酵母抽提物19.7 g/L，棉籽饼粉25.0 g/L，豆油5.0 g/L时，硫酸镁2.0 g/L，氯化钠2.0 g/L，碳酸钙2.0 g/L，菌株摇瓶发酵产量5978 mg/L。结论 通过菌种诱变选育与配方优化，PF1022A的摇瓶产量较出发菌株提高了96%，具有工业应用价值。

关键词：座坚壳菌；PF1022A；菌种选育；响应面分析法；发酵

中图分类号：R978.1文献标志码：A

Mutation breeding and optimization of fermentation medium of PF1022A producing strain

Xiang Renxing， Sun peng， Yang Xiaohu， Pan Linlin， Fang Jiashuang， Ying Lingping， and Xu qian

（Zhejiang Key Laboratory of Antifungal Drugs， Zhejiang Hisun pharmaceutical Co. Ltd.， Taizhou 318000）

Abstract Objective To optimize PF1022A fermentation conditions to improve the titer of fermentation by screening of PF1022A high-producing strain. Methods The PF1022A-producing Rosellinia sp. HS-NF-1412Z （3050 mg/L）， was used as the starting strain and treated by UV. The fermentation conditions were optimized by the single-factor experiment and the Box Behnken （BB） response surface method. Results A high producing and stable strain HS-NF5-86-5-88 was obtained. The yield of fermentation increased 19% compared with the starting strain in shake flask cultures. The optimized fermentation medium consists of maltodextrin 163.0 g/L， yeast extract 19.7 g/L， cottonseed meal 25.0 g/L， soybean oil 5.0 g/L， magnesium sulphate 2.0 g/L， sodium chloride 2.0 g/L， and calcium carbonate 2.0 g/L. The titer of PF1022A achieved 5，978 mg/L in the optimized media. Conclusion The titer of PF1022A was increased by 96% compared to the original strain through mutation breeding and optimization of fermentation medium， which is promising for industrial applications.

Key words Rosellinia sp; PF1022A; Strain selection; Response surface method; Fermentation

寄生蟲病是目前最为严重的人畜共患病之一，严重影响着畜牧业的健康发展与人类的生命安全。艾默德斯（emodepside）是一种24元环8缩酚酸肽化合物，对无脊柱动物（如线虫、蛔虫）等有杀伤作用[1]。拜尔动物保健公司已研制出emodepside分别与吡喹酮（profender）及妥曲珠利（procox）的组合物用于猫和狗的驱肠虫药，profender（与吡喹酮联用）已于2007年在美国上市。2014年12月， DNDi与拜耳公司合作开发emodepside，用于治疗潜在的丝虫病及盘尾丝虫病（人用药），于2016年进入健康志愿者I期研究，2017年完成了单次递增剂量研究，2018年底完成了多次递增剂量研究[2]。

PF1022A（图1）[3]作为emodepside化学合成关键前体原料，具有非常好的经济价值。目前PF1022A的合成有生物合成方法和固相合成法[3-6]。固相合成法步骤繁琐、工艺复杂，不适于大规模生产，而关于PF1022A发酵生产报道比较少，PF1022A是座坚壳菌菌株Rosellinia sp. PF1022产生的N-甲基-CODP（环状缩肽）类化合物，是1种对动物低毒、防治谱广、效果好的驱虫药物，其是继大环内酯类驱虫药后，最有潜力的用于牲畜和宠物的一类驱虫药[7-8]。根据公开的资料[8-11]，其整体产PF1022A 的能力较低。

本课题组在进行微生物新药筛选过程中，于浙江丽水遂昌山的土壤样品中成功分离得到1株产PF1022A 的座坚壳菌HS-NF-1412Z[12]，本文通过对其菌种诱变选育、单因素试验，同时结合响应面優化发酵培养基配方[13-14]，提高了PF1022A的发酵水平，降低生产成本，有利于实现该项目的产业化。

1 仪器与材料

1.1 实验菌株

座坚壳菌HS-NF-1412Z菌株保藏于浙江海正药业股份有限公司菌种鉴定保藏中心。

1.2 培养基

固体培养基（g/L）：马铃薯（去皮）200，葡萄糖20，琼脂18，pH 6.0。

种子培养基（g/L）：葡萄糖20，玉米可溶性淀粉20，酵母抽提物15，棉籽饼粉20，硫酸镁2，氯化钠2，碳酸钙2， pH 6.0。

初始发酵培养基（g/L）：玉米淀粉120（淀粉酶0.024），大豆油10，棉籽饼粉25，酵母粉10，硫酸镁2，氯化钠2，碳酸钙2，pH 6.0。

1.3 主要仪器与试剂

摇床：美国NBS INNOVA-5000摇床系统；分析型高效液相色谱仪：Shimadu，SPD-20A；分析色谱柱：大连依利特科学仪器有限公司，Hypersil ODS2柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；PF1022A标准品由本实验室分离鉴定，纯度达99.0%以上。

2 方法与结果

2.1 培养条件

斜面培养：将保存的菌种接种至斜面培养基，25 ℃培养6～9 d。

种子培养：取菌种斜面转接于装量25 mL/250 mL种子培养基中，培养温度25 ℃，摇床转速250 r/min，培养72 h。

摇瓶发酵培养：将种子液以5%移种量转移至装量25 mL/250 mL发酵培养基中，培养温度25 ℃，摇床转速250 r/min，培养9 d。

2.2 PF1022A的含量测定

吸取0.5 mL发酵液，加入12倍体积甲醇超声30 min，4000 r/min离心10 min，取上清液过滤，滤液测HPLC。色谱条件：Hypersil ODS2柱（5 μm，4.6 mm×

250 mm），流动相为乙腈：水（80：20， V/V），流速1 mL/min，检测波长218 nm，柱温30℃，进样量20 μL，样品出峰时间约9.5 min。根据对照品浓度计算发酵液中PF1022A的含量。

2.3 菌种诱变与筛选

紫外（UV）诱变：将培养好的斜面菌种用无菌水洗脱制成菌悬液，吸取5 mL置灭菌的9cm培养皿中，在15 W紫外灯下，距离25 cm处分别照射30、60和120 s。照射后的菌悬液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度稀释，取0.1 mL涂布于固体培养基，25℃培养7 d，得到紫外诱变后的单菌落。结果显示，UV照射60 s，座坚壳菌的致死率为90%，挑取单菌落至固体培养基进行扩大培养，按“2.1”项方法进行摇瓶发酵培养，从中挑选发酵产素提高的高产突变株，经过连续几轮UV诱变后，筛选得到2株高产突变菌株HS-NF4-39和HS-NF5-86，并对这2株高产突变株进行自然分离，分别得到HS-NF4-39-3-42和HS-NF5-86-5-88，PF1022A的产量分别为3639 mg/L和3670 mg/L，相对出发菌株HS-NF-1412Z（3050 mg/L）提升19%以上。

将HS-NF4-39-3-42和HS-NF5-86-5-88高产菌株分别接种至斜面培养基连续传代5次，分别按“2.1”项下方法进行发酵培养，结果如表1所示，连续传代3次高产突变株PF1022A产量都没有显著降低，继续传代2次，HS-NF4-39-3-42菌株PF1022A产量显著降低，HS-NF5-86-5-88菌株PF1022A产量相对稳定，表明菌株HS-NF5-86-5-88的传代稳定性较好，更适合工业化生产。

2.4 发酵培养基单因素优化

2.4.1 碳源单因素试验

以初始发酵培养基为基础培养基，分别用麦芽糖、麦芽糊精、糖蜜、蔗糖、甘油替代玉米淀粉作为碳源，浓度为120 g/L，按“2.1”项下方法发酵培养9 d后测定PF1022A，实验结果显示（图2）。

由结果可知，该菌株对上述多种碳源利用情况不同，蔗糖与糖蜜为碳源时，PF1022A产量最低，麦芽糊精为碳源时，PF1022A产量达4350 mg/L，可能与其含有的维生素、微量元素有关，故最优碳源为麦芽糊精。

2.4.2 麦芽糊精添加量对PF1022A产量的影响

根据上述实验结果，对麦芽糊精进行浓度梯度实验（8%、10%、12%、14%、16%和18%），考察其对PF1022A产量的影响，实验结果显示（图3），麦芽糊精添加量为8%～16%，PF1022A产量随着麦芽糊精添加量的增加总体呈上升趋势，继续提升麦芽糊精的浓度，PF1022A产量开始降低。根据上述结果初步确定麦芽糊精的浓度为16%。

2.4.3 氮源单因素试验

根据上述实验结果，分别考察花生饼粉、小麦胚芽粉、黄豆饼粉、豆粉、鱼粉、酵母抽提物和棉籽饼粉替代酵母粉作为氮源，浓度均为10 g/L，按“2.1”项方法进行摇瓶发酵培养9 d后测量PF1022A的产量。结果显示（图4），菌株对酵母抽提物的利用程度最高，以酵母抽提物为氮源时PF1022A产量达到5313 mg/L。

2.4.4 酵母抽提物添加量对PF1022A产量的影响

根据上述实验结果，对酵母抽提物进行浓度梯度实验（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%），考察其对PF1022A产量的影响，实验结果显示（图5），酵母抽提物添加量0.5%～1.5%，PF1022A产量随着酵母抽提物的添加量加大逐步提升，最高达5580 mg/L，后续再提高酵母抽提物浓度，发酵产量呈一定的下降趋势，根据上述结果初步确定酵母抽提物的浓度为1.5%。

2.4.5 棉籽饼粉添加量对PF1022A产量的影响

根据上述结果，进一步考察了组合氮源中棉籽饼粉的添加量（2.25%、2.5%、2.75%和3%）对PF1022A产量的影响。结果显示（图6），棉籽饼粉添加量在2.25%～3%对PF1022A产量无显著差异，2.5%棉籽饼粉PF1022A产量相对较高，初步确定棉籽饼粉浓度为2.5%。

2.4.6 油类单因素试验

根据上述实验结果，分别用菜籽油、油酸甲酯、肉豆蔻酸异丙酯与豆油进行发酵对比，浓度均为10g/L，

按“2.1”项方法进行摇瓶发酵培养9d后测量PF1022A的产量。实验结果显示（图7），豆油与肉豆蔻酸异丙酯的利用情况较好，由于豆油相对肉豆蔻酸异丙酯价格低廉，更有利于商业化生产，故更优选为豆油。

2.4.7 豆油添加量对PF1022A产量的影响

根据上述实验结果，进一步对豆油进行浓度梯度实验（0.5%、0.75%、1%、1.25%和1.5%），考察其对PF1022A产量的影响。实验结果显示（图8），豆油添加量0.5%～0.75%，PF1022A的产量具有一定的提升，最高达5748 mg/L，繼续提升豆油添加量后，PF1022A的产量呈逐渐下降趋势，根据上述实验结果初步确定豆油添加量为0.75%。

2.5 响应面分析法优化

响应面分析法是通过对响应面等值线的分析寻求最优工艺参数，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应面之间函数关系的1种统计方法[15-19] 。

根据上述各发酵因素对PF1022A产量的影响程度，从中选取3个影响较为显著的因素：麦芽糊精（A）、酵母抽提物（B）和豆油（C），应用Design Expert8.06软件，采用Box-Behnken方法对座坚壳菌HS-NF5-86-5-88产PF1022A发酵工艺进行三因素三水平试验，以麦芽糊精（A）、酵母抽提物（B）、豆油（C）为自变量，试验结果见表2。

对表2的试验数据进行响应面二次回归拟合，得到二次多项回归方程：Y效价=5736.67-88.38A+132.00B-136.38C+176.25AB-82.50AC-65.25BC-526.08A2-119.33B2-25.58C2

并对上述回归模型进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，回归模型的P=0.0002，失拟P为0.1521＞0.05，因此该模型显著，失拟不显著。该模型的校正系数ADJ R2=0.9376，R2=0.9775，该模型方程与实际拟合好，预测值与实际值的相关性好，模型响应值的变异系数CV值1.11%较低，表明实验操作是可信的，因此可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析。由回归方程各项方差分析表明，麦芽糊精、酵母抽提物、豆油对产PF1022A影响显著，麦芽糊精与酵母抽提物、麦芽糊精与豆油之间的交互作用显著，其响应面图及等高线图如图所示（图9～10），对上述模型求最大值，通过分析可得，麦芽糊精163.0 g/L、酵母抽提物19.7 g/L、豆油5.0 g/L，菌株HS-NF5-86-5-88产PF1022A的最大值为5939 mg/L，优化后发酵培养基成分：麦芽糊精163.0 g/L，酵母抽提物19.7 g/L，豆油5.0 g/L，棉子饼粉25.0 g/L，硫酸镁2.0 g/L，氯化钠2.0 g/L，碳酸钙2.0 g/L。

采用优化后的发酵培养基进行验证试验，平行3瓶，实测值为5978 mg/L，与理论值5939 mg/L偏差约0.65%，实际测量值与预测值相接近，可见该模型能够较好的预测实际发酵情况。

3    结论

通过对出发菌株座坚壳菌HS-NF-1412Z进行连续UV诱变及自然选育，最终获得一株高产菌株HS-NF5-86-5-88，发酵水平具有一定幅度的提升，再通过单因素试验及响应面优化发酵培养基，优化后的发酵培养基为麦芽糊精163.0 g/L，酵母抽提物19.7 g/L，棉籽饼粉25.0 g/L，豆油5.0 g/L时，硫酸镁2.0 g/L，氯化钠2.0 g/L，碳酸钙2.0 g/L，菌株摇瓶PF1022A的发酵水平达5978 mg/L，较出发菌株（3050 mg/L）提高了96%。

Emodepside作为高端兽用驱虫药目前尚未在国内上市，关于其前体PF1022A菌种和发酵工艺的报道也比较少，除本研究外，王昆蓉等[10]对菌株SIIA-16-1#采用麦芽糖为主要碳源，PF1022A发酵水平最高达1810 mg/L，陈少欣等[7]对菌株NBRC-33096采用葡萄糖、山梨醇、玉米淀粉为主要碳源，发酵罐补加麦芽糖，PF1022A发酵水平最高达到1481 mg/L，本研究对菌株HS-NF-1412Z进行选育[12]，高产突变株HS-NF5-86-5-88采用麦芽糊精为主要碳源进行发酵，其PF1022A发酵产量远高于目前文献所报道的水平。另外，全合成Emodepside路线长，工艺复杂，控制条件要求高，工艺路线实现比较困难，不利于大规模生产，而从前体PF1022A出发，通过半合成制备emodepside，合成步骤缩减，工艺实现简单，前体发酵水平提高后生产成本大幅降低。因此，本研究为后期工业化放大生产奠定了良好的基础。

参 考 文 献

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收稿日期：2022-09-13

作者简介：项仁鑫，男，生于1991年，工程师，主要研究方向为微生物药物，E-mail： rxxiang@hisunpharm.com

*通信作者，E-mail： tzxuqian@hisunpharm.com