APP下载

蝇蛆抗氧化肽的制备及其纯化

2016-12-12巫春旭卢雪梅褚夫江王敏

农业与技术 2016年19期
关键词:分离纯化

巫春旭++卢雪梅++褚夫江++王敏++金小宝++朱家勇

摘 要:以DPPH自由基清除率为评价指标,通过单因素试验和正交试验优化碱性蛋白酶水解蝇蛆蛋白制备抗氧化肽的工艺条件。采用超滤、Sephadex G25凝胶过滤层析对蝇蛆蛋白水解物进行分离纯化,筛选高抗氧化活性组分。结果表明,酶法制备蝇蛆蛋白抗氧化肽的最佳工艺条件为:加酶量7000 U/g,底物质量浓度1%,酶解时间15 min,酶解温度50℃,pH值7.5。水解物经超滤得到相对分子量大于10 kD、5~10 kD以及小于5 kD的组分,以小于5 kD组分清除DPPH自由基活性最强。该组分通过凝胶过滤层析进一步分离得到2个组分,其中组分Ⅱ的清除DPPH活性明显高于组分Ⅰ,达到81.83 ± 0.80%。酶解产物经2步纯化后,其DPPH清除活性得到了显著提高,提高约57.88%。

关键词:家蝇幼虫;抗氧化肽;工艺条件;分离纯化

中图分类号: Q969.97 文献标识码:A DOI:10.11974/ nyyjs.20160909001

家蝇(Musca domestica)幼虫,又名五谷虫,俗称蝇蛆,其干燥物为中药罗仙子。据《本草纲目》记载,罗仙子具有“治小儿诸疳积、疳疮,热病谵妄,毒痢作吐”的功效。现代科学实验表明,蝇蛆富含蛋白,并且其组成氨基酸较为齐全,另外还有丰富的维生素、甲壳素、矿物质以及微量元素等,具有较高的营养价值[1]。从蝇蛆中提取的抗菌肽对耐药菌株具有较强的抑制活性[2],在鸡饲料中添加蝇蛆肽具有调节和改善鸡肠道菌群以及提高营养物质可利用率的作用[3],在鲫鱼饲料中添加蝇蛆粉可增强鱼体非特异性免疫功能[4]。说明蝇蛆在饲料、食品添加剂方面具有较高的潜在应用价值。此外,研究发现蝇蛆提取物还具有清除氧自由基[5]、抗炎和抗动脉粥样硬化的作用[6],提示蝇蛆可能是一种良好的食品、保健品资源,为蝇蛆更深度的开发利用提供了新的方向。

抗氧化多肽作为天然抗氧化剂,与合成抗氧化剂相比,具有更高的安全性。而蝇蛆繁殖周期短,饲养成本低廉,因此,从蝇蛆中制备抗氧化肽不失为一种好的选择。目前,主要通过酶解法和发酵法来制备抗氧化肽。本试验以DPPH自由基清除率为抗氧化活性评价指标,优化酶解法制备蝇蛆抗氧化肽工艺条件,并对酶解产物进行分离纯化,为蝇蛆抗氧化肽的开发利用提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

种蝇,获赠于广东省疾病与控制中心,双翅目(Diptera),蝇科(Muscidae),蝇属(Musca),家蝇(M.domestica);3日龄家蝇幼虫,由实验室自行繁殖饲养获得;碱性蛋白酶(P4860-50ML),SIGMA公司产品;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH),SIGMA公司产品。

1.2 仪器

电子天平,Sartorius公司提供;分光光度计U-2900,HITACHI公司提供;HH-3A数显恒温三温水浴锅,金坛市精达仪器制造厂提供;电热鼓风干燥箱,上海恒科学仪器有限公司提供;高速冷冻离心机,Eppendorf公司提供;Lab scale小型切向流超滤系统,Millipore公司提供;快速蛋白纯化系统,由AKTA公司提供。

2 试验方法

2.1 家蝇幼虫的处理及蛋白提取

收集3日龄家蝇幼虫,用蒸馏水反复清洗以去除杂物,经沸水烫漂后置于50℃烘干,粉碎,索氏脱脂(溶剂为石油醚),烘干,过40目筛,备用。

称取脱脂蛆粉50g,加水500mL,充分混匀,调pH至10.5左右,置于50℃恒温水浴锅,提取3h。浸提后以5000 r/min离心15min,取上清液。再调pH至4.5,于4℃下静置2h。以5000 r/min离心15min,取沉淀,将pH调至7.0,透析以脱盐,冷冻干燥后备用[7]。

2.2 家蝇幼虫蛋白酶解单因素试验

以DPPH自由基清除率为评价指标分别考察加酶量、底物质量浓度、酶解时间、温度和pH 5个因素对家蝇幼虫蛋白抗氧化肽制备的影响,每个因素设置5个水平进行单因素试验。

2.3 家蝇幼虫蛋白酶解正交试验

在前期单因素试验基础上,以加酶量、底物浓度、时间、温度和pH 5个因素设计正交表L18(37)进行正交试验,见表1。

2.4 DPPH自由基清除活性测定

DPPH是一种合成的以氮为中心的稳定自由基,已广泛用于各种提取物或化合物的抗氧化活性评价及筛选工作中。本试验以DPPH自由基清除率为抗氧化活性评价指标,分离并筛选活性组分。

取0.1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液2mL,与2mL待测样品混匀,室温避光反应30min,在517nm处测得吸光度为Ai;取2 mL待测样品与等体积无水乙醇混合,反应30min,在517nm处测得吸光度为Aj;取2mL蒸馏水与等体积的DPPH溶液混合,同上操作,在517 nm处测得吸光度为A0,则待测样品对DPPH的清除率为:K=(A0 – Ai + Aj)/A0 × 100%[8]

2.5 超滤

采用小型切向流超滤系统进行家蝇幼虫蛋白酶解液的分离,滤膜截留分子量分别为10kD和5kD。超滤时进口压为0.14MPa,出口压为0.08MPa。超滤完成后分别收集各分子段组分,并测定DPPH清除活性,选择活性最高的组分进行凝胶柱层析分离。

2.6 Sephadex G25凝胶柱层析

实验采用GE HiPrep26/10预装脱盐柱,其填料为 SephadexG25,柱体积为53mL。上样量为500μL,洗脱液为脱气蒸馏水,线性流速为30cm/h,检测波长254 nm,按峰收集,并分别测定DPPH清除活性。

3 结果与分析

3.1 单因素试验分析

3.1.1 加酶量对酶产物抗氧化活性的影响

设定底物质量浓度为1%,加酶量分别为1000U/g、3000U/g、5000U/g、7000U/g、9000U/g,在pH值为8.0,温度为50℃的条件下反应20min,后置于85℃水中灭酶5~10min,经5000 r/min的转速离心10min后,分别测定上清DPPH清除活性,结果见图1。由图1可知,酶解产物DPPH清除率随加酶量的增加呈逐步升高趋势,并且在5000 U/g之前提升明显,之后则趋于平缓,在7000 U/g左右达到最大。若考虑到成本,加酶量设在6000 U/g左右为宜。

3.1.2 底物质量浓度对酶解产物抗氧化活性的影响

设定加酶量为5000 U/g,pH值为8.0,温度50℃,时间20min,底物质量浓度分别设置为1%、2%、3%、4%和5%,考察不同底物质量浓度对酶解产物DPPH清除率的影响,结果见图2。由图2可知,在底物质量浓度为2%左右时,DPPH清除率达到最大,浓度过低或过高都不利于酶促反应的进行。因此,底物浓度为2%左右最佳。

3.1.3 时间对酶解产物抗氧化活性的影响

设定加酶量5000U/g,底物质量浓度为1%,pH值为8.0,温度50℃,平行设置5个组分别反应5、10、15、20、25min,考察不同反应时间对酶解产物抗氧化活性的影响,结果见图3。由图3可知,在15min之前,酶解产物对DPPH的清除率随时间的增加而提高;而15min之后,DPPH清除率不再升高,反而有轻微下降趋势。因此,反应时间控制在15min左右较为合适。

3.1.4 温度对酶解产物抗氧化活性的影响

设定加酶量5000U/g,底物质量浓度为1%,pH值为8.0,温度分别设置为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃,考察不同温度对酶解产物抗氧化活性的影响,结果见图4。由图4可以看出,酶解产物DPPH清除率随温度的升高呈略微先增后降的趋势,但是变化较小,温度设置在50~55℃之间对DPPH清除活性影响不大。

3.1.5 pH对酶解产物抗氧化活性的影响

设定加酶量5000U/g,底物质量浓度为1%,温度50℃,pH值分别为6.5、7、7.5、8.0、8.5,考察不同pH值对酶解产物抗氧化活性的影响,结果见图5。由图5可知,随着pH的增加,酶解产物活性呈先增后减的趋势,当pH值在7.5时,DPPH清除率达到最大。因此,最适pH在7.5左右。

3.2 正交试验分析

采用正交试验确定最佳酶解工艺条件试验结果见表2。从表2中各因素的R值可知,各因素对酶解产物抗氧化活性的影响大小顺序为:B>A>C>E>D,最优条件组合为A3B1C3D2E2,即加酶量7000 U/g,底物质量浓度1%,酶解反应时间15 min,酶解温度50℃,pH值7.5。

3.3 蝇蛆蛋白酶解液的超滤分离结果

蝇蛆蛋白酶解液经超滤分离得到3个分子段组分,分别为Mr ≥ 10 kD、5 kD ≤ Mr ≤ 10 kD以及Mr ≤ 10kD 。不同分子段组分质量浓度与DPPH自由基清除率的关系如6图所示。从图6中可以看出,3个组分DPPH清除率均随质量浓度的增大而升高,呈现出一定的量效关系。分子量大于10kD的组分清除DPPH自由基活性明显低于10kD以内的组分,而分子量在之内的组分清除DPPH自由基活性最强,因此选择分子量10kD以内的组分进行下一步分离。

3.4 Sephadex G25凝胶层析结果

凝胶柱层析为空间排阻色谱,其原理是按照分子量大小不同进行分离,分子量越大,出峰越快。Sephadex G25葡聚糖凝胶柱的分离范围是1000~5000,适合超滤得到DPPH清除活性最强组分(分子量5kD以内)的分离,其分离结果如图7所示。超滤得到Mr ≤ 5kD组分经Sephadex G25分离得到2个主峰分别为组分Ⅰ和组分Ⅱ,比较同浓度(1mg/mL)组分Ⅰ、组分Ⅱ以及未纯化酶解液DPPH清除活性(表3),可知,组分Ⅱ的DPPH清除活性明显高于组分Ⅰ,达到81.83±0.80%,较未纯化酶解液清除率提高了57.88%。

4 结论与讨论

蝇蛆体内具有多种活性成分,是重要的资源昆虫之一。蝇蛆作为饲料或添加剂应用于养殖业,可增强家禽免疫力、提高肉的质量[9];不仅如此,从蝇蛆中提取的蛋白、多肽还具有一定的清除自由基、抗动脉粥样硬化的作用,因此可作为功能食品资源开发利用。

本文以DPPH自由基清除率为抗氧化能力评价指标,通过单因素和正交试验确定了蝇蛆蛋白制备抗氧化肽的最佳酶解工艺条件为:加酶量7000U/g,底物质量浓度1%,酶解时间15min,酶解温度50℃,pH值7.5。经超滤和Sephadex G25柱层析的2次纯化后,其DPPH清除活性提高了57.88%,达到81.83 ± 0.80%,具有较强的抗氧化活性,因此有望作为抗氧化剂应用于功能、保健食品。

在本试验中,2步纯化结果都表明,分子量小的组分表现出更好的抗氧化活性,这一结论与大豆多肽类似[10]。不过,由于单一蛋白酶水解的位点有限,因此水解产物仍有可进一步水解的空间。因此,后续可以尝试结合其他多种蛋白酶进行水解。但是,酶解得到的多肽抗氧化活性是否随分子量的减小一直呈上升趋势呢?这有待进一步研究。若蛋白水解致使抗氧化活性的提高与其水解导致活性位点暴露有关的话,那么必定存在这样的情况,即水解到一定程度后,活性位点已经完全暴露,继续水解不会再使抗氧化活性得到提高,因此找到合适的多酶配合水解方案以及合适的水解度将能有效提高水解效率,并减少不必要的资源浪费。

参考文献

[1]张泽生,姚国雄.家蝇幼虫作为人类潜在食物蛋白质资源的探索[J].食品工业科技,1997(06):67-69.

[2]屈军梅,黄庭汝,屈孝初,等.家蝇抗菌肽的分离纯化及生物学活性 [J].中国兽医学报,2007,27(3):387-390.

[3]张爱忠,姜宁,张婷,等.不同家蝇幼虫制品对黄羽肉仔鸡营养物质可利用率、肠道菌群和血清生化指标的影响[J].动物营养学报,2012,24(5):911-917.

[4]李小波.家蝇幼虫粉作为饲料添加剂在鲫鱼养殖中的应用 [D].南方医科大学,2013.

[5]刘彬,黄文,张洁,等.家蝇幼虫提取物清除氧自由基的作用[J].应用昆虫学报,2006,43(1):85-88.

[6]Jiang C F,Bao J X, Ye X Y,et al. Inflammatory Regulation Effect and Action Mechanism of Anti-Inflammatory Effective Parts of Housefly (Musca domestica) Larvae on Atherosclerosis[J].Evidence-based complementary and alternative medicine:eCAM,2013, 2013(1):340267-340267.

[7]肖燕平,黄培霞,董烨平,等.蚕蛹蛋白抗氧化肽的制备及其纯化[J].农产品加工(学刊),2011(3):11-13.

[8]Cai L,Wu X,Zhang Y,et al. Purification and characterization of three antioxidant peptides from protein hydrolysate of grass carp ( Ctenopharyngodon idella ) skin [J]. Journal of Functional Foods,2015,16(3):234-242.

[9]Hwangbo J,Hong E C, Jang A,et al. Utilization of house fly-maggots,a feed supplement in the production of broiler chickens[J].Journal of Environmental Biology,2009,30(4):609-614.

[10]张东杰,马中苏.凝胶过滤色谱分离大豆抗氧化肽活性的研究 [J].中国酿造,2010(6):41-44.

作者简介:巫春旭(1993-),男,广东药科大学研究生,研究方向:昆虫活性物质功能。

猜你喜欢

分离纯化
番茄红素分离纯化研究
车前子多糖的分离纯化及其功能性质研究
大鼠骨髓基质干细胞的体外培养及诱导分化
双齿围沙蚕化学成分及其浸膏抗肿瘤活性的研究
水磨年糕中微生物的分离纯化与鉴定
一种新的镰刀菌Q7—31木聚糖酶Xyn9的分离纯化鉴定及酶学特性
红蓝草紫色素分离纯化研究
豆甾醇的研究及开发进展
康氏木霉内切β—葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质
天然活性多糖提取及分离纯化技术研究进展