1株鱼类水霉病原真菌拮抗菌的发酵条件优化

梁永增+魏冬梅+王磊

摘要：采用单因素试验分别探讨温度、pH值、接种量、碳源、氮源、无机盐对鱼类水霉病原真菌拮抗菌菌株生长的影响，并在单因素试验结果的基础上，利用正交试验设计对培养基组分进行优化。结果显示，JL04最适培养温度为 32 ℃，最适培养pH值为5，接种量对菌体生长的影响不显著。由正交试验结果得出最佳发酵培养基为胰蛋白胨 6 g/L、葡萄糖6 g/L、酵母提取物3.5 g/L、硝酸铵3.5 g/L、硫酸镁2 g/L、氯化钙3 g/L、硫酸锰1 g/L，最佳培养时间为18 h。在此优化条件下，该菌株发酵培养达到对数生长末期的时间缩短了2 h，能较快进入菌体密度最大的时期，为该菌株的高密度生产提供了一定依据。

关键词：鱼病；水霉病；条件优化；发酵；拮抗菌

中图分类号： S941.43+1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0141-05

水霉病（Saprolegniasis）是严重威胁淡水养殖鱼类的世界性病害。水霉病是继发性感染疾病，流行很广泛[1]，一年四季均可发病[2]，晚冬、初春季节尤为严重，对寄主无严格的选择性，水产动物及卵均可被感染，对养殖产业造成了巨大经济损失[3-4]。以生物拮抗为核心的生物防治方法具有绿色、环保、安全、高效的优点，近年来水产领域水霉病生物防治研究进展较快[5]，代表了水霉病防控研究的主流方向。生态防治在控制病原菌数量、减少鱼类疾病发生的同时还能改善养殖环境、维护微生态平衡；因此，水霉病生态防治拮抗菌的开发变得尤其重要，拮抗菌的发酵条件也成为重点研究课题。

对水霉病的治疗现已进行了多种尝试，最初采用孔雀石绿、氯化钠、臭氧、福尔马林[6]，其中孔雀石绿的治疗效果最好，但由于孔雀石绿具有相当强的副作用并造成严重的污染，目前已被禁用[7]。在对水霉病各方面的研究中，一种更为有效的解决途径是利用生物间的相互作用控制水霉。近年来，中外学者对水霉病生物防治的研究已取得了一定成果，张书俊等[8]、刘莉莉等[9]、赵春晖等[10]、Balcázar等[11]已筛选出对水霉具有较强抑制作用的拮抗菌，并对其拮抗物质进行了初步的分离鉴定。笔者所在实验室分离得到1株水霉病原真菌拮抗菌JL04，经鉴定为枯草芽孢杆菌，以下简称“JL04菌株”。以JL04菌株为研究对象，对其发酵培养基组分及发酵培养条件进行优化，为今后JL04菌株的大规模发酵培养提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 供试菌种为水霉病原菌拮抗菌中具有广谱抑菌性的菌株JL04，由笔者所在实验室前期筛选得到。以LB斜面保存于4 ℃冰箱中。

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖培养基（合成培养基，pH值7.0）用于水霉的培养和保存。牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5.0 g/L）用于细菌的分离、培养、保存。LB培养基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，pH值7.0）用于细菌的发酵培养。

1.1.3 试剂与仪器 主要试剂见表1，仪器设备见表2。

1.2 方法和步骤

1.2.1 水霉菌株及其拮抗菌株的培养 从长满水霉菌丝的平板上切取直径为1 cm的水霉琼脂块，接种于水霉培养基平板中央，于25 ℃下恒温培养。将保存于4 ℃冰箱中的JL04菌株用接种环挑取菌落，在LB培养基平板上划线，于37 ℃下恒温活化培养。活化后的JL04菌株用于发酵培养。

1.2.2 JL04菌株拮抗作用广谱性 采用平板对峙培养法，分别对12株“1.2.1”节活化完成的水霉菌株进行拮抗广谱性试验。将直径1 cm的水霉琼脂块接种于PDA培养基平板中央，距水霉琼脂块一侧25 mm处，接种20 μL发酵培养的拮抗菌JL04于灭菌滤纸片上，放置0.5 h，于25 ℃下恒温倒置培养72 h，观察拮抗效果。

1.2.3 拮抗菌株JL04生长曲线测定 将JL04菌株接种于100 mL LB液体培养基中，置于37 ℃、120 r/min摇床中振荡培养12 h，用作种子液。取25个250 mL锥形瓶，每瓶装有100 mL LB液体培养基，以0.5%的接种量将菌悬液接入24个锥形瓶，以无菌LB液体培养基作为空白对照，均置于 37 ℃、120 r/min搖床中振荡培养。分别于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 h取样，采用紫外分光光度计测定D值（λ=600 nm），每份样品测定3次取平均值。如果菌悬液浓度过高，适当稀释后再进行测定。以培养时间为横坐标、D600 nm值为纵坐标，绘制拮抗菌JL04的生长曲线。

1.2.4 JL04菌株培养条件的优化

1.2.4.1 JL04菌株温度条件的优化 将拮抗菌JL04种子培养液按照0.5%的接种量接种至100 mL LB发酵培养基中，均调pH值至7.0，分别置于27、32、37、42 ℃下以 120 r/min 摇床培养20 h，测定不同温度下JL04菌株培养液的D600 nm值。每组试验设3个平行。

1.2.4.2 JL04菌株最适初始pH值的确定 采用1 mol/L HCl或NaOH将LB发酵培养基的pH值分别调至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按0.5%的接种量将JL04种子培养液接种至不同pH值的培养液中，置于37 ℃、120 r/min摇床中振荡培养20 h，测定不同pH值下JL04培养液的D600 nm值。每组试验设3个平行。

1.2.4.3 JL04菌株最佳接种量的确定 接种量设置梯度为1%、2%、3%、4%、5%。将拮抗菌接种于LB发酵培养液，在上述优化后的pH值和温度下发酵，制成种子菌液，以不同接种量接种于100 mL液体培养基中，置于37 ℃、120 r/min摇床中振荡培养20 h，测定不同接种量发酵液的D600 nm值。每组试验设3个平行。

1.2.5 JL04菌株培养基组分优化

1.2.5.1 碳源优化 以1%硫酸铵为氮源，选择葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、麦芽糖、葡萄糖+胰蛋白胨（质量比1 ∶1）、可溶性淀粉+胰蛋白胨（质量比1 ∶1）替代LB基础液体发酵培养基中的胰蛋白胨制成培养基，用量均为1%，配成100 mL培养液，调节pH值至7.0。将JL04菌株种子培养液按照0.5%的接种量接种至不同碳源的培养液中，置于 37 ℃、120 r/min摇床中振荡培养20 h。测定不同碳源JL04培养液的D600 nm值。每组试验设3个平行。

1.2.5.2 氮源优化 以1%蔗糖为碳源，选择酵母提取物、尿素、牛肉膏、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾+酵母提取物（1 ∶1）、硝酸铵+酵母提取物（1 ∶1）、硫酸铵+酵母提取物（1 ∶1）、硝酸钾+硫酸铵（1 ∶1）为氮源，分别以0.5%的量配成100 mL培养液，调节pH值至7.0。将JL04培养液按照0.5%的接种量接种至不同氮源的培养液中，置于37 ℃、120 r/min 摇床中振荡培养20 h。测定不同氮源JL04培养液的D600 nm值。每组试验设3个平行。

1.2.5.3 无机盐优化 以1%蔗糖为碳源、0.5%酵母浸膏为氮源，选择氯化钙、硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸锰、硫酸镁+氯化钙+硫酸锰（质量比2 ∶3 ∶1）代替LB液体培养基中的氯化钠制成培养基，分别以1%的量配成100 mL培养液，调节pH值至7.0。将JL04种子悬液以0.5%的接种量接种至不同无机盐的培养液中，置于37 ℃、120 r/min摇床中振荡培养20 h。测定不同无机盐JL04培养液的D600 nm值。每组试验设3个平行。

1.2.6 正交试验 正交试验用以优化培养基最佳用量配比。通过单因素试验确定了JL04菌株发酵培养的最佳碳源、氮源、无机盐。采用L9（33）正交表（表3）进行试验，以0.5%的接种量接菌悬液，每个培养基组合设3个平行，共9组试验。均置于37 ℃、120 r/min摇瓶发酵培养20 h，测定发酵液的D600 nm值，以确定最佳培养基组合。每组试验设3个平行。

1.2.7 优化后生长曲线的测定 将JL04菌株接种于100 mL优化后的液体培养基中，置于37 ℃、120 r/min摇床中振荡过夜培养，用作种子悬液。取25个250 mL锥形瓶，每瓶装 100 mL 优化后的液体培养基，以0.5%的接种量将菌悬液接入24个锥形瓶，以无菌LB液体培养基作为空白对照，均置于37 ℃、120 r/min摇床中振荡培养。分别于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 h取样，采用紫外分光光度计测定D600 nm值，每份样品取样3次并取测量结果的平均值。如果菌悬液浓度过高，适当稀释后再进行测定。以培养时间为横坐标、D600 nm值为纵坐标，绘制JL04菌株在优化后培养基中的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 JL04菌株对鱼类水霉病病原菌水霉的拮抗效果

采用平板对峙培养法，由试验结果（图1）可知，JL04菌株对12株水霉病原真菌均有拮抗性，JL04菌株是生物防治水霉病的1株理想菌株，因此对具有广谱抑菌性的JL04菌株进行发酵条件优化尤为重要。

2.2 生长曲线测定

拮抗菌JL04菌株在LB液体培养基中的生长曲线见图2。该菌株在LB培养基中0～4 h处于潜伏期，菌体生长量少；4 h后进入对数生长期，菌体数量急剧增加；于20 h达到生长高峰；20～36 h进入稳定期。试验结果表明，JL04菌株在液体培养基中的增殖情况符合细菌的一般生长规律，经历了延迟期、 对数期、 稳定期、衰亡期。在20 h后JL04菌株生长进入了稳定期，细菌增殖不明显；因此，在LB培养基中发酵20 h为拮抗菌JL04菌株对数生长的末期，此时期内收集的菌液适合作为种子悬液。

2.3 JL04菌株培养条件的优化

2.3.1 JL04菌株温度条件的选择 温度对蛋白质及生物酶的活性影响很大，而蛋白质和生物酶又是生物代谢过程中的重要物质，因此温度对于微生物的生长具有很大影响。培养温度过低或过高均会造成微生物生长缓慢，甚至导致微生物死亡。由图3可知，32 ℃条件下JL04菌株长势最好，与其他温度相比差异显著，因此拮抗菌JL04的最适生长温度应在 32 ℃ 左右。试验结果表明，JL04菌株对温度比较敏感，在进行培养时，32 ℃是比较理想的温度。

2.3.2 最适初始pH值的确定 pH值能影响微生物细胞膜表面电荷及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力。另外，pH值還能改变酶活性、酶促反应的速率及代谢途径。过碱性或过酸性的环境会导致微生物生长缓慢，甚至导致细菌死亡。

细菌在生长过程中所产生的胞外物质会改变发酵液的pH值，因此仅能控制其初始pH值。由图4可知，拮抗菌JL04在初始pH值为5～6时长势最好，与其他组相比差异显著，可见拮抗菌JL04更适合在略偏酸性的环境中生长。试验结果表明，培养基的初始pH值为5～6时更适合JL04菌株的生长。

2.3.3 接种量的选择 接种量是与培养基的利用率直接相关的量。接种量太大则菌种吸收不到足够多的营养，菌数不高且造成浪费；接种量太小对营养利用不充分，且细菌发酵周期延长，增加染菌概率。分别以不同接种量（1%、2%、3%、4%、5%）接种于培养基中进行发酵培养，以培养得到的拮抗菌株发酵液的D600 nm值表示菌量。由图5可知，接种量在3%时拮抗菌JL04的长势最好。单因素方差分析表明， 5个接种量之间没有显著性差异，因此接种量对拮抗菌JL04的发酵生长影响不大。

2.4 JL04菌株培养基组分优化

2.4.1 碳源优化 根据微生物所能产生的酶系不同，不同微生物可利用不同的碳源。碳源对微生物生长代谢的作用主要是提供细胞的碳架，提供细胞生命活动所需的能量，提供合成产物的碳架。碳源在制作微生物培养基或细胞培养基时具有重要作用，为微生物或细胞的正常生长、分裂提供物质基础。由图6可知，以10 g/L胰蛋白胨+葡萄糖（1 ∶1）为碳源的发酵液D600 nm值最高，与其他单一碳源相比差异显著；其次为胰蛋白胨+可溶性淀粉（1 ∶1），再次分别为葡萄糖、可溶性淀粉；而果糖、麦芽糖、蔗糖作为碳源时发酵液的D600 nm值均低于原培养基，因此选用胰蛋白胨+葡萄糖（1 ∶1）作为碳源。

2.4.2 氮源优化 微生物生长和产物合成需要氮源，氮源主要用于菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物的合成。氮源是微生物必需的营养物质之一，对微生物的生命活动意义重大。由图7可知，JL04菌株在以酵母提取物+硝酸铵（1 ∶1）为氮源的培养基中长势最好，其次为酵母提取物+硫酸铵（1 ∶1），再次分别为酵母提取物+硝酸钾（1 ∶1）、酵母提取物、牛肉膏、硝酸钾+硫酸铵（1 ∶1）、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾、尿素。该结果可能的原因是有机氮源与无机氮源相比更易被利用，因此有机氮源对菌体生长更加有利。试验结果表明，选用酵母提取物+硝酸铵（1 ∶1）作为氮源有利于JL04菌株的发酵培养。

2.4.3 无机盐种类的优化 无机盐是细胞的结构成分，参与并维持生物体的代谢活动，维持生物体内的酸碱平衡及渗透压。对微生物生长的重要性可见一斑。由图8可知，以硫酸镁+氯化钙+硫酸锰（2 ∶3 ∶1）作为无机盐的培养基发酵液D600 nm值最高；其次分别为氯化钙、硫酸镁、硫酸锰；而磷酸氢二钾作为无机盐时，发酵液的菌量均没有原培养基效果好，因此选用硫酸镁+氯化钙+硫酸锰（2 ∶3 ∶1）作为培养基的无机盐。

2.5 正交试验结果

由表4可知，发酵培养基组分的最佳组合为A3B3C1，即拮抗菌JL04菌株的最佳培养基为6 g/L胰蛋白胨+6 g/L葡萄糖+ 3.5 g/L酵母提取物+3.5 g/L硝酸铵+2 g/L 硫酸镁+3 g/L氯化钙+1 g/L硫酸锰。极差分析表明，RA>RB>RC，即各因子对菌体浓度的影响大小依次为葡萄糖+胰蛋白胨>硝酸铵+酵母提取物>硫酸镁+氯化钙+硫酸锰。由表5可知，葡萄糖+胰蛋白胨差异显著，而硫酸镁+氯化钙+硫酸镁在统计学上没有显著性差异。

2.6 拮抗菌JL04在发酵培养基中生长曲线的测定

由图9可知，该菌株在优化后的培养基中0～4 h处于潜伏期，菌体生长量少；4 h后进入对数生长期，菌体数量急剧增加；18 h达到生长高峰；18～36 h进入稳定期。在优化培养基中发酵18 h为拮抗菌JL04菌株对数生长的末期，此时期内收集的菌液适合作为菌种液，能得到高浓度的菌体。

与优化前的培养基相比，拮抗菌JL04在优化后培养基中的对数生长末期提前了2 h，缩短了菌体发酵培养时得到最高浓度菌量的培养时间；而且优化前后该菌达到对数生长末期时的菌量不同，优化后对数生长末期菌量明显增大，这对于大量产生菌体来抑制水霉病原菌具有一定意义。

3 结论与讨论

通过单因素试验和正交试验，初步得到了实验室条件下JL04菌株液体发酵的培养基优化配方，即6g/L胰蛋白胨、6 g/L 葡萄糖、3.5 g/L酵母提取物、3.5 g/L硝酸铵、2 g/L硫酸镁、3 g/L氯化钙、1 g/L硫酸锰。发酵条件的研究结果表明，菌株JL04对温度和pH值较为敏感，其生长最适温度为32 ℃，最适pH值为5～6，接种量对菌体生长的影响不显著。筛选后的培养基碳源、氮源、无机盐明确，且菌株JL04在优化后的培养基中达到对数生长末期的时间缩短，能较快进入菌体密度最大期，为该菌株的高密度生产提供依据。

本试验仅在实验室条件下对发酵培养基的组成及其培养条件进行了优化，而拮抗菌制剂生防作用的发挥与制备工艺、使用方法以及菌剂使用时的温度、湿度、pH值等环境因素密切相关。在拮抗菌制剂商业化过程中，一方面要继续加强对拮抗菌活性物质发酵工艺、提取与纯化方法等的研究，另一方面要加强对拮抗菌制剂发挥最佳作用条件的研究，需在发酵罐和水环境下进行验证。本试验对最佳碳源、氮源、无机盐离子和正交试验法优化培养基配比进行了研究，仅以液体发酵培养基中的总菌含量作为指标，并没有其他与之相对应的筛选模型作为依据，因此可能对试验结果造成一定误差，但并不影响本研究所得结果。今后的研究中可设计类似试验方案，以进一步验证本试验的准确性和完整性。

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