两种不同方法制作犬心房颤动模型的安全性分析

麦麦提阿卜杜拉·麦麦提敏 杨徐 张玲 麦麦提艾力·麦麦提敏 曹桂秋 李耀东 孙华鑫 马嵋 汤宝鹏

心房颤动(简称房颤)作为一种临床上最常见的快速性心律失常,发病率随着年龄的增加逐渐升高。一项基于全球人口研究的系统回顾性研究显示,1997 年观察到的每百万人中新增房颤病例309例,2007 年观察到的每百万人中新增房颤病例为345 例,2017 年报告的每百万人中新增房颤病例超过400 例,有明显的增加趋势[1],预测未来几十年中房颤发病率会升高2～3 倍。目前治疗房颤的方法有电转复、药物治疗、射频消融术、外科手术等,但都具有一定的局限性。通过对房颤动物模型的研究,可以加深对房颤病理生理的认识,从而有助于改进房颤的治疗[2-4]。目前可用于制作房颤模型的动物有犬、兔、羊、马、猪、鼠等,制作方法各不相同,安全性及有效性也各不相同[5-8]。探索出制作房颤动物模型的有效且安全的方法,不仅能减少动物的痛苦及成本,更有助于研究房颤形成的相关机制。本研究通过比较开胸植入电极和X 线透视下颈静脉植入电极的方法制作心房快速刺激模型的安全性,为制作房颤动物模型提供数据和理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

12 只健康雄性比格犬,由新疆医科大学动物实验中心提供[普通级,许可证号:SYXK(新)2018-0002],体重平均(13±2)kg,犬龄均在1～2 岁。所有犬造模前均通过了由兽医进行的精神状况、躯体健康状况评估。课题实验设计、实验方案及具体实施步骤已经新疆医科大学第一附属医院动物伦理委员会审核批准(审批号:K202111-07)。实验实施推进过程严格按照美国国立研究机构设立的实验动物使用和护理指南进行。

1.2 实验分组及处理方法

根据起搏器电极植入途径,将全部犬只分为开胸组和介入组,每组6 只。术前12 h 禁饮食,麻醉前观察精神、步态、声音等状态并称重。手术当日肌注麻醉剂舒泰+速眠新注射液(0.05 mL/kg,1 ∶1)混合物进行基础麻醉,通过观察睫毛反射和舌头牵拉阻力评估麻醉是否生效。麻醉成功后,操作区域剃毛。选择前肢头静脉植入静脉留置针开通静脉通道,然后以3%戊巴比妥钠溶液(20 mg/kg)静脉维持麻醉,间断输入0.9%氯化钠注射液、5%葡萄糖注射液(补充能量),根据睫毛反射动态追加3%戊巴比妥钠注射液(10 mg/kg)维持麻醉。将电热毯通电,使整个实验过程中体温稳定在37.5～38 ℃。进行气管插管,将指夹式血氧探头夹在犬舌上用于监测血氧饱和度,必要时采用呼吸机辅助呼吸。选择股动脉和股静脉进行穿刺并留置股动静脉鞘。

在整个实验过程中,使用Lead-7000 型多导电生理记录仪(成都锦江公司产品)连续监测心电图标准肢体导联、腔内心电图和动脉血压。留置导尿管并连接尿袋,检测尿量。

(1) 开胸组:将犬取右侧卧位置于大动物手术台,用碘酒、酒精消毒前胸及左侧颈胸部。以左腋前线4—5 肋间隙为手术入口,绷紧皮肤,逐层切开皮肤、皮下组织,将开胸器调至最小化后置于手术切口中,拨开肺组织,撑开胸廓,充分显露手术野,小心打开心包,充分显露左心耳,采用荷包缝合方式将起搏电极缝合固定于左心耳底部,保证起搏电极与心耳部组织充分接触,两电极缝合点间距0.5 mm,将其余电极分别置于右侧前胸及左侧颈肩部。用多导电生理记录仪描记体表基础状态心电图,采用磁铁开启起搏器[购自恩识医疗科技(上海)有限公司,自带4 根电极],观察起搏器工作情况。如果起搏器工作状态良好,则关闭起搏器。检查心包、心脏表面及胸腔无出血后,在胸部皮下构建囊袋,将起搏器埋藏于已建立好的皮下囊袋内。术毕仔细观察有无局部出血,关闭胸腔,抽取胸腔内积液、积气,逐层缝合肌肉、皮下组织及皮肤,局部切口消毒,用无菌纱布包扎。见图1A。

图1 开胸组、介入组植入起搏器过程

(2) 介入组:将犬仰卧位置于大动物手术台上,用碘酒、酒精消毒颈胸部皮肤,指腹确认颈静脉位置,绷紧皮肤,逐层切开皮肤、皮下组织,分离颈静脉,用缝合线结扎远心端,用手术刀切开颈外静脉,从切口插入起搏器电极(购自美敦力或圣犹达公司的心房电极),确认电极在血管真腔后,在X 线透视下,将起搏器电极经颈外静脉送入右心房并固定,经测试确定电极阻抗、感知、起搏功能良好后,将起搏器电极与动物专用起搏器(购自哈尔滨理工大学)连接,用Lead-7000 多导电生理记录仪描记体表基础状态心电图,采用磁铁开启起搏器,观察起搏器工作情况。如果起搏器工作状态良好,则关闭起搏器。在颈部皮下构建囊袋,将起搏器埋藏于已建立好的皮下囊袋内。术毕仔细观察有无局部出血,逐层缝合肌肉、皮下组织及皮肤,局部切口消毒,用无菌纱布包扎。见图1B-D。

两组术后均给予陆醒宁注射液催醒。待动物恢复自主呼吸后再拔出气管插管,送回观察室继续观察;待其意识完全恢复后,送返动物房继续单笼饲养。术后在犬清醒状态下使用盐酸吗啡注射液止痛,20 mg,8 h 一次,皮下注射,共2 次;头孢唑啉钠剂针1.5 g,一日两次,匀速静脉滴注,连续使用3 d 预防感染;牛奶、牛肉火腿肠、鸡蛋等营养支持1 周;每日观察精神、饮食、体温及活动情况;常规换药、拆线。待一般情况稳定后开启起搏器予以连续起搏6 周,起搏频率400 次/min。每日采用Powerleb体表监测仪监测体表心电图,并保证起搏状态为持续性起搏。

1.3 手术安全性评估

术后通过观察伤口、监测体温、检测降钙素原、检测NT-proBNP 等,评估是否有皮下感染、囊袋感染、血性感染、感染性心内膜炎、心力衰竭(简称心衰)、休克、死亡等。

1.4 腔内电生理检测

经股静脉将10 级电极送至右心房,尾端连接Lead-7000 多导电生理仪。当腔内电生理图呈现出大A 小V 波形,表示电极置入右心房成功。随后需进行电极位置测试,当给予心房电极以1～2 V 电压进行起搏时,均可见信号下传,表示放置电极位置良好。关闭起搏器后,心电记录中若心房波出现无序活动的“f”波,且持续5 s 以上,则认为房颤诱发成功。如房颤自行出现提示自发房颤,则记录房颤持续时间;如果房颤发作后持续出现,不能自行终止,持续时间超过5 min,则按照5 min 进行计算,待其自行恢复窦性心律后再进行下一次的刺激诱发。如无自发性房颤,则采用Burst 刺激进行诱发:给予60 ms 的S1S1程序刺激,设定刺激电压为8 V,连续刺激10 s。分别在基线状态和6 周后检测是否有房颤发作。

1.5 心脏超声检查

在造模前及造模结束后进行超声心动图检查。检查均由超声医学科的高年资医师专人操作。检测指标包括左心房内径、左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic diameter,LVESD)、左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、右心房内径、右心室内径和射血分数。在相同的时间节点测量每个变量,重复3 次取平均值。

1.6 统计学分析

采用SPSS 22.0 进行统计分析,对符合正态分布的计量数据用表示,均数比较行t检验;计数资料用例数(%)表示,率的比较用χ2检验,以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

12 只犬中,开胸组有1 只术后第3 天死亡,死因考虑是感染性休克;介入组有1 只术后第7 天猝死,X 线检查提示电极脱落至心室,考虑死因为电极脱位致恶性心律失常而发生猝死;其余10 只犬完成整个实验,均能诱发房颤(图2)。

图2 两组常规体表Ⅱ导联心电图和心腔内电生理图显示成功诱发房颤

2.1 超声检查结果

两组起搏6 周后的心脏结构都有一定程度变化,两组左心房内径、LVESD、LVEDD、右心房内径、右心室内径均较起搏前明显增大(P均＜0.05),但两组射血分数起搏前后均无明显变化。见表1-2。

表1 开胸组植入起搏器前后心脏超声指标的变化 n=5,

表1 开胸组植入起搏器前后心脏超声指标的变化 n=5,

表2 介入组X 线透视下颈外静脉途径植入起搏器前后心脏超声指标的变化 n=5,

表2 介入组X 线透视下颈外静脉途径植入起搏器前后心脏超声指标的变化 n=5,

2.2 两组心衰发生率比较

开胸组3 只犬分别在快速心房起搏后3、12 和20 d 出现喘憋,双肺可闻及湿啰音和散在哮鸣音,实验室检查提示降钙素原正常,NT-proBNP 明显升高,分别为8 973、9 743、9 224 pg/mL,考虑为急性左心衰竭。停止起搏后,给予利尿、甲基强的松龙、氨茶碱治疗。3 d 后症状均明显好转,无喘气,双肺未闻及湿啰音和哮鸣音,复查NT-proBNP 恢复正常。

介入组1 只犬快速心房起搏后12 d 出现喘憋,双肺可闻及湿啰音和散在哮鸣音,实验室检查提示降钙素原正常,NT-proBNP 增高至7 483 pg/mL,考虑为急性左心衰竭。停止起搏后,给予利尿、甲基强的松龙、氨茶碱治疗4 d,症状明显好转,无喘气,双肺未闻及湿啰音和哮鸣音,复查NT-proBNP 恢复正常。两组心衰发生率比较,差异有统计学意义(χ2=18,P＜0.05)。

2.3 两组感染发生率比较

开胸组4 只犬出现囊袋血肿,均出现在术后1 周内,分别为术后1、2、2、3 d 。股静脉抽取血样本,检测降钙素原浓度,均在正常范围,给予每日2 次换药、抽吸、静脉滴注抗生素等处理后,2 只恢复正常,2 只进展为囊袋感染。发生囊袋感染的2 只犬囊袋有波动感,伤口可见脓性分泌物,继续给予抗生素静脉滴注,每12 h 1 次,同时在囊袋内注射抗生素。5 d 后2 只犬囊袋未见明显血肿,伤口愈合尚可,但其中1 只出现发热,监测降钙素原明显升高(4.15 ng/mL),考虑全身性感染。对这只发生全身性感染的犬继续给予抗生素静脉滴注,每12 h 1 次,换药每日2 次。3 d 后无明显发热,伤口愈合好。

介入组2 只犬出现囊袋血肿,均出现在术后第2 天,从股静脉抽取血样本检测降钙素原浓度,结果显示均正常。给予每天换药2 次、抽吸等处理。经处理后,1 只恢复正常;1 只进展为囊袋感染,囊袋有波动感,伤口可见脓性分泌物,降钙素原正常,继续给予抗生素静脉滴注,每12 h 1 次,同时在囊袋内注射抗生素,2 d 后囊袋裂开,可见起搏器及电极,降钙素原浓度升高至6.85 ng/mL。对发生囊袋感染的犬通过全麻进行伤口切开清创术,并重新缝合,继续给予每日2 次换药、抽吸、静脉滴注抗生素等处理,未再出现血肿、囊袋感染、全身感染,伤口逐渐愈合。两组感染发生率比较,差异有统计学意义(χ2=18,P＜0.05)。

3 讨论

房颤是最常见的临床心律失常,根据发作时间分为阵发性、持续性和永久性房颤[9-12]。对房颤动物模型的深入研究,可以加深对房颤病理生理的认识,从而有助于改进房颤的治疗。目前常用的房颤动物模型有:早期的在犬右心耳尖注射少量乌头碱诱发房颤以及后期的采用刺激双侧颈部迷走神经干和乙酰胆碱灌流的方法诱发房颤;MORILLO 等[13]在犬右心耳放置起搏电极,以400 次/min 的频率快速起搏犬心房;WIJFFELS等[14]在山羊心房外膜埋置电极片,以50 Hz 的频率刺激左心房1 s,诱发出短阵房颤;在肺静脉根部含有自主神经节的脂肪垫分别注射拟副交感神经的乙酰胆碱和碳酰胆碱诱发房颤[15];无菌性心包炎模型;心衰性房颤模型;低通气动物模型;衰老和转基因动物模型等[16]。

快速心房起搏模型制作简单,容易诱发心房肌电重构。既往有研究认为,右心房高频刺激为心房扑动,左心房高频刺激多为房颤;但也有研究得出相反的结论,即右心房高频刺激为房颤,左心房高频刺激多为心房扑动。本研究中开胸组为左心房起搏,介入组为右心房起搏,两组房颤诱发率无明显差异,均能诱发房颤,我们认为房颤时两心房可能没有固定的激动模式,这与KONINGS 等[17]的研究结果一致。在本实验的12 只犬中,开胸组中1 只犬术后第3 天死亡。此犬死亡前一天伤口充血,有淡黄色分泌物,皮温较高,给予继续静脉滴注抗生素、换药处理;发现此犬死亡时距上次观察8 h,其四肢已僵硬,皮肤冰凉,伤口可见分泌物,考虑死亡时间较长,没有进行尸检,推测死因可能是感染性休克。介入组中1 只犬术后7 d 猝死,发现死亡时已距上次观察2 h,X 线检查提示电极脱落至右心室,考虑电极脱位导致右心室快速起搏,进一步诱发心室颤动等恶性心律失常,最终导致猝死。而电极脱位可能因为电极植入时间较短,电极头端的纤维包绕尚未形成,电极不牢固,活动时发生电极脱位。

本研究中,心脏B 超提示,两组均有心脏结构改变,这种结构的变化显然有利于折返环的形成,导致房颤的发生和维持。两组均有急性心衰发生,其中开胸组3 只,介入组1 只,给予对症治疗后均纠正;开胸组心衰发生率明显高于介入组。手术应激、心房快速起搏、感染均会引起心衰,开胸组手术创伤较大、感染风险也大,可能更容易发生心衰。心衰和房颤会相互作用,心衰会诱发房颤,房颤也会诱发心衰,两组的心衰发生率虽然有差异,但房颤诱发率无差异,两组均能诱发房颤,而且给予对症治疗后心衰很快得到纠正,因此推测本研究中心衰的出现对房颤的诱发贡献不大,但是增加了术后感染、猝死等风险。开胸组与介入组中均发生了感染,但开胸组感染发生率也明显高于介入组。虽然整个手术严格按无菌原则进行,术后予以常规消毒换药、营养支持,术中也尽量选择不易舔或抓的部位制作囊袋,但术后仍不能完全避免犬舔或抓伤口,不能完全保证伤口一直保持无菌,导致两组感染率均较高。开胸组可能是由于手术伤口较大,感染率明显高于介入组。为了避免术后犬舔或抓伤口而使感染的发生率升高,实验过程中使用了马甲和犬脖套,但有些犬佩戴马甲和犬脖套后变得更加烦躁,出现乱跳、以头撞笼子边缘的情况,总体效果不明显;发现伤口有分泌物时,及时进行细菌培养,并选择敏感抗生素,同时采用延长抗生素使用疗程、增加换药频次等措施,可能有助于降低感染发生率。

总之,开胸植入电极与X 线透视下颈外静脉植入电极,均能制作房颤模型,均能引起心脏结构的改变。开胸组开胸左心耳固定电极,电极植入更为稳定,但感染率、心衰发生率均高于介入组。介入组手术伤口小,但是需要使用数字减影血管造影机、铅衣等设备,术中需要在X 线透视下操作,对实验团队的资质、操作熟练程度、抢救设备等要求较高。从单纯考虑降低感染率和心衰发生率的角度而言,X 线透视下经颈静脉植入电极的方法优于开胸植入电极制作房颤犬模型。但是在房颤研究中,还要考虑到房颤的电生理特征,因此在电生理特征的变化上是否有差异,需要进一步研究。