木霉菌协同杀菌剂防治北苍术白绢病的增效作用

贺字典，韩亚梅，金 歌，高玉峰，闵 康

（1.河北科技师范学院农学与生物科技学院/河北省作物逆境生物学重点实验室，秦皇岛 066600；2.河北科技师范学院学报编辑部，秦皇岛 066600）

北苍术Atractylodeschinensi主要分布在海拔50～2000 m 的燕山山脉，为河北省道地药材之一。河北省北苍术种植区域主要为秦皇岛市青龙满族自治县和承德市隆化、滦平、平泉、宽城、丰宁、围场等县，因在新冠肺炎治疗中发挥了重要作用，到2025 年，河北省北苍术种植面积要达到3333 hm2，形成一地供全国的局面。由齐整小核菌Sclerotiumrolfsii侵染北苍术发病后茎基部成烂麻状，仅剩下纤维束，且在根茎表皮上长出白色菌丝和红褐色菌核。该病菌不仅侵染北苍术，还为害花生[1]、辣椒[2]、剑豆[3]、茅苍术[4]、白术[5]、铁皮石斛[6]、太子参[7]等作物、蔬菜和中药材，白绢病已成为农业生产上一种危害巨大的土传病害。

目前，白绢病的防治仍以化学防治为主，10%苯醚甲环唑水分散粒剂（water dispersible granule，WG）和10%三唑酮可湿性粉剂（wetting powders，WP）对齐整小核菌菌丝的抑菌率分别为79.9%和66.8%[8]。噻呋酰胺对北苍术白绢病的防治效果为68.72%[9]。苯甲·嘧菌酯1500 倍液对铁皮石斛白绢病的防治效果为90.27%[10]。50%异菌脲悬浮剂（suspension concentrate，SC）和24%噻呋酰胺SC 对花生白绢病的防治效果分别为44.6%～68.7%和66.1%～79.4%[11]。但齐整小核菌对多菌灵、嘧菌酯、腐霉利和嘧霉胺等多种杀菌剂均已产生了抗药性[12]。为降低齐整小核菌的抗药性，筛选和应用生防菌防治白绢病已有报道。贝莱斯芽胞杆菌Bacillusvelezensis对齐整小核菌菌丝的抑菌率达到81.93%，对花生白绢病的田间防治效果为66.15%[13]。贝莱斯芽胞杆菌FJAT-17931 和暹罗芽胞杆菌BacillussiamensisFJAT-52595 对太子参白绢病菌的抑菌率分别为73.23%和71.16%[7]。哈茨木霉TrichodermaharzianumH2对齐整小核菌菌丝的抑菌率达到86.27%[14]。由于生防菌防治效果易受到环境条件、施用方法、杀菌剂等诸多因素的影响，导致防治效果不稳定和速效性差，因此发挥化学杀菌剂与生防菌各自优势，将二者联合应用成为研究热点。

木霉菌与代森锰锌、三唑酮、啶酰菌胺等杀菌剂联合使用不仅对香蕉枯萎病、百合贮存期鳞茎腐烂病、番茄灰霉病等病害防治效果提高了19.26%～29.29%[15-17]，而且能够协同防治印度橡胶榕和鱼腥草白绢病[18,19]，但木霉菌与杀菌剂协同防治北苍术白绢病的报道很少[9]。因此为了进一步提高木霉菌与杀菌剂协同对北苍术白绢病防治效果，减少化学杀菌剂用量，本文采用生长速率法、平板对峙法和协同系数法从12 种杀菌剂中筛选出与7 种木霉菌具有生物相容性和增效作用的杀菌剂后，测定杀菌剂比对照减少50%用量时，木霉菌与杀菌剂协同对北苍术白绢病的田间防治效果，以期为北苍术白绢病绿色防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

木霉菌株：哈茨木霉T.harzianumT11、长枝木霉TrichodermalongibrachiatumT12、棘孢木霉Trichoderma asperellumT13、绿色木霉TrichodermavirideT14、深绿木霉TrichodermaatrovirideT15、棘孢木霉Trichoderma asperellumT16、粘绿木霉TrichodermavirenT17，由河北科技师范学院保存。

病原菌：齐整小核菌S.rolfsii, 由河北科技师范学院保存。

杀菌剂：30%噻唑锌SC，浙江新农化工股份有限公司；80%多菌灵WP，河北冠龙农化有限公司；80%代森锰锌WP，利民化工股份有限公司；250 g/L 嘧菌酯SC，先正达南通作物保护有限公司；30%噁霉灵水剂（aqueous solution，AS），四川国光农化股份有限公司；20%噻菌铜SC，浙江龙湾化工有限公司；200 g/L氟酰羟·苯甲唑SC，瑞士先正达作物保护有限公司；62.5 g/L 精甲·咯菌腈悬浮种衣剂（flowable concentrate for seed coating，FS），先正达南通作物保护有限公司；43%唑醚·氟酰胺SC，巴斯夫（中国）有限公司；240 g/L 噻呋酰胺SC，河北三农农用化工有限公司；30%吡唑醚菌酯SC，华北制药集团爱诺有限公司；450 g/L咪鲜胺水乳剂（emulsion in water，EW），江苏辉丰生物农业股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 将4 ℃保存的木霉菌菌株和齐整小核菌分别接种于PDA 平板上，25 ℃培养至长满培养皿，备用。

1.2.2 菌核的收集 将齐整小核菌菌饼接种于PDA 平板上，待菌丝表面长出菌核后，用无菌镊子夹取菌核置于培养皿中，备用。

1.2.3 木霉菌对齐整小核菌菌丝和菌核萌发的抑制作用 待齐整小核菌和木霉菌长满培养皿后，用直径5 mm 的打孔器分别在齐整小核菌和木霉菌菌落边缘打取菌饼。将木霉菌与病原菌同时接入PDA 平板上。二者相距3 cm，同时设只接种病原菌为对照，3 次重复，置于25 ℃培养箱中黑暗培养3 d 后测量病原菌指向木霉菌的菌落半径，计算木霉菌对齐整小核菌菌丝的抑菌率[7]。抑菌率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－菌饼直径）×100。

将长满培养皿的木霉菌，用5 mL无菌水清洗，用血球计数板测定分生孢子浓度达到1.27×108孢子/mL，吸取1.0 mL 孢子悬浮液均匀涂布于PDA 培养基表面。待悬浮液被PDA 完全吸收后，于每个平板上放置10 个菌核，以只接种菌核为对照，3 次重复。逐日记录菌核萌发数量和萌发后菌丝菌落直径，计算齐整小核菌菌核萌发率和对萌发菌丝的抑菌率[20]。菌核萌发率（%）=（萌发菌核数量/菌核总数量）×100。木霉菌对萌发菌丝的抑菌率（%）=（对照菌落直径－处理菌落直径）/对照菌落直径×100。

1.2.4 杀菌剂对齐整小核菌菌丝的毒力作用 采用菌丝生长速率法测定12 种杀菌剂对齐整小核菌菌丝的毒力作用。30%吡唑醚菌酯SC、30%噻唑锌SC 和30%噁霉灵AS 的浓度均为3000、600、120、24 和4.80 μg/mL；80%多菌灵WP 浓度为1600、320、64、12.8 和2.56 μg/mL；80%代森锰锌WP 浓度为10000、2000、400、80 和16 μg/mL；20%噻菌铜SC 的浓度为2000、400、80、16 和3.2 μg/mL；250 g/L 嘧菌酯SC 的浓度为1000、200、40、8.0 和1.6 μg/mL；200 g/L 氟酰羟·苯甲唑SC 的浓度为800、160、32、6.4 和1.28 μg/mL；62.5 g/L 精甲·咯菌腈FS 浓度为1250、250、50、10 和2 μg/mL；43%唑醚·氟酰胺SC 浓度为860、172、34.4、6.88 和1.38 μg/mL；240 g/L 噻呋酰胺SC 浓度为960、192、38.4、7.68 和1.54 μg/mL；450 g/L 咪鲜胺EW浓度分别为1800、360、72、14.4 和2.88 μg/mL。用PDA 培养基配制成含系列梯度浓度杀菌剂含药平板，以加无菌水为对照。用直径5 mm 的打孔器从培养5 d 病原菌的菌落边缘打取菌饼，菌丝面向下接种于含不同浓度杀菌剂平板上，3 次重复。25 ℃黑暗培养3 d 后，采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率和有效中浓度（effective concentration，EC50）。

1.2.5 杀菌剂和木霉菌生物相容性测定 采用菌丝生长速率法测定12种杀菌剂对3个木霉菌菌株T16、T15、T11的毒力作用。杀菌剂浓度同1.2.4。用PDA 培养基配制成含系列梯度浓度的杀菌剂培养基平板，以加无菌水为对照。用直径5 mm 的打孔器从培养5 d 的新鲜木霉菌菌落边缘打取菌饼，菌丝面向下接种于含不同浓度农药的平板上，3 次重复。25 ℃黑暗培养3 d 后，采用十字交叉法测菌落直径，计算抑菌率和EC50。根据杀菌剂对木霉菌菌丝的EC50（TEC50）与该杀菌剂对齐整小核菌的EC50（REC50）比值（VEC50，VEC50=TEC50/REC50）筛选可与木霉菌协同使用的杀菌剂，若VEC50＞1，认为该化学杀菌剂可与木霉菌协同使用[17]。

1.2.6 杀菌剂和木霉菌协同对齐整小核菌菌丝的抑制作用 采用平板对峙法测定与木霉菌相容性好的杀菌剂和木霉菌协同对齐整小核菌菌丝的抑制作用。用无菌水分别将30%噁霉灵AS 配制浓度为100.00、75.00、66.70 和50.00 μg/mL。80%代森锰锌WP 的浓度梯度为0.94、0.71、0.63、0.47 μg/mL。240 g/L 噻呋酰胺SC 的浓度为24.00、18.00、16.00 和12.00 μg/mL。在含药PDA 平板上同时接种直径为5 mm 木霉菌和齐整小核菌的菌饼，二者间隔3 cm，以只接种齐整小核菌或木霉菌菌饼为对照，3 次重复。置于25 ℃恒温培养箱中黑暗培养3 d，测量二者菌落的相向半径。采用协同系数法[21]评价木霉菌与化学杀菌剂协同使用是否产生增效作用。协同系数（S）=（病菌对照菌落半径－病菌拮抗菌落半径）/（木霉菌对照菌落半径－木霉菌拮抗菌落半径）×100。S≥1.5，表示木霉菌和杀菌剂具有增效作用；1≤S＜1.5，表示木霉菌和杀菌剂具有相加作用；S＜1，表示木霉菌和杀菌剂具有拮抗作用。

1.2.7 杀菌剂和木霉菌协同对北苍术白绢病的防治效果 将木霉菌用食用菌玉米粒培养基培养7 d[22]，待长满木霉菌后用蒸馏水洗出后用血球计数板计数，分生孢子数量调整到1×107孢子/mL，备用。

在秦皇岛市卢龙县燕河营镇旭阳药材种植园测定北苍术白绢病防治效果。该基地种植北苍术面积5.47 hm2，移栽2 年生苗，平作，株行距为15 cm×30 cm。该基地前茬种植玉米、白薯、辣椒等农作物，调查该地农田白绢病发生严重，地表20～30 cm 深处的菌核数可达5×105～1×107菌核/m2。

试验小区分别为木霉菌与杀菌剂协同作用、杀菌剂单独应用对照、木霉菌单独应用对照和清水对照，每个小区长150 m，宽3 m，共19 个处理，3 次重复。协同作用分别为棘孢木霉T16与噻唑锌、代森锰锌、噻呋酰胺和噁霉灵；深绿木霉T15与代森锰锌、噻呋酰胺和噁霉灵；哈茨木霉T11与噻唑锌、代森锰锌、噻呋酰胺和噁霉灵。

杀菌剂协同作用区木霉菌用量为37.5 L/hm2，对照区为75.0 L/hm2；30%噁霉灵AS、30%噻唑锌SC、80%代森锰锌WP 和240 g/L 噻呋酰胺SC 的用量在协同作用区均为7.5 kg/hm2，对照区均为15.0 kg/hm2。棘孢木霉T16、深绿木霉T15和哈茨木霉T11采用分生孢子悬浮液，孢子浓度为1×107孢子/mL。于2021年6 月2 日先将杀菌剂滴灌到北苍术根际后，再滴施木霉菌孢子悬浮液直到根际土壤湿透，8 月7 日调查白绢病病情指数，调查时采用S 形取样法，每个处理选取10 个点，每个点调查50 株，根据北苍术白绢病病情指数分级标准[9]调查发病情况，计算病情指数和防治效果。

北苍术白绢病病情指数分级标准：0 级，无病；1 级，根茎有轻微变褐；3 级，根茎组织变褐；5 级，根茎开始腐烂，腐烂面积占总面积的30%以下，并出现少量白色菌丝；7 级，腐烂部分占根茎30%以上，地上部植株萎蔫，产生大量菌核；9 级，整株枯死。病情指数=[∑（病级数×该病级植株数）]/（最大病级数×植株总株数）×100。防治效果（%）=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数×100。

1.2.8 数据统计与分析 试验数据使用Excel 2019 和SPSS 24.0 软件进行统计分析，利用LSD 法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 木霉菌对齐整小核菌菌丝和菌核萌发的抑制效果

棘孢木霉T16菌株对齐整小核菌菌丝的抑菌率最高，为87.52%，其次深绿木霉T15和哈茨木霉T11对齐整小核菌菌丝的抑菌率分别为79.61%和77.67%，三者差异并不显著。齐整小核菌菌核在深绿木霉T15和棘孢木霉T16中萌发率均为0，对菌核萌发后菌丝的抑菌率达到100%，显著高于绿色木霉T17和哈茨木霉T11对菌核萌发后菌丝的抑菌率（表1，图1）。

表1 木霉菌对齐整小核菌菌丝和菌核萌发的抑菌率Table 1 Inhibition rate of Trichoderma on mycelia and sclerotinia germination of S.rolfsii

图1 木霉菌对齐整小核菌菌丝和菌核的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of Trichoderma on mycelium and sclerotium of S.rolfsii

2.2 杀菌剂对齐整小核菌和木霉菌的EC50

通过测定比较12 种化学杀菌剂对齐整小核菌和木霉菌的EC50，噻呋酰胺、代森锰锌和噁霉灵与棘孢木霉T16、深绿木霉T15和哈茨木霉T11间的生物相容性好，VEC50均大于1；噻唑锌与棘孢木霉T16、哈茨木霉T11间VEC50均大于1，生物相容性好（表2）。

表2 化学杀菌剂与木霉菌的生物相容性Table 2 Bio-compatibility between chemicalfungicides and Trichoderma

2.3 化学杀菌剂与木霉菌协同对齐整小核菌的抑制作用

2.3.1 杀菌剂与木霉菌协同增效作用 棘孢木霉T16、深绿木霉T15和哈茨木霉T11与噁霉灵、噻呋酰胺和代森锰锌协同应用后对齐整小核菌菌丝的抑菌率均达到100%。噁霉灵、噻呋酰胺与3 种木霉菌间的协同系数均大于1，表现出增效作用。代森锰锌、噻唑锌与棘孢木霉T16、哈茨木霉T11的协同系数均大于1，表现出增效作用（表3）。

表3 杀菌剂与木霉菌对齐整小核菌菌丝的协同增效作用Table 3 Synergism between Trichoderma and fungicides to inhibit Sclerotium rolfsii mycelium

2.3.2 木霉菌与杀菌剂协同对北苍术白绢病田间防治效果 噻呋酰胺与棘孢木霉T16、深绿木霉T15协同防治北苍术白绢病的效果分别达到80.76%和78.82%，与噻呋酰胺对照相比，虽然防治效果差异未达到显著水平，但防治效果分别增长了13.36%和10.64%；与2 种木霉菌对照的防治效果分别增长了33.47%和77.88%，均显著高于各木霉菌对照处理。同样，与代森锰锌对照相比，代森锰锌与棘孢木霉T16、深绿木霉T15和哈茨木霉T11协同防治效果差异并不显著，但防治效果分别增加了37.12%、30.15%和15.38%（表4）。

表4 木霉菌和杀菌剂协同对北苍术白绢病的田间防治效果Table 4 Synergistic control effect of Trichoderma and fungicide on sclerotium blight of A.rhizome in the field

3 讨论

木霉菌的种类、孢子类型等均会影响木霉菌与杀菌剂的协同应用效果。TRS060186 对多菌灵的耐药性比哈茨木霉TRW079634 强[23]。哈茨木霉可以与五氯硝基苯协同使用，不能与多菌灵协同使用；长枝木霉可以与和甲霜灵协同使用，不能与戊唑醇协同使用[24]。本文从7 种木霉菌中筛选出了3 种可以与噻呋酰胺、代森锰锌和噁霉灵均具有相容性的棘孢木霉、深绿木霉和哈茨木霉，可以进一步研究菌药协同对根腐病、立枯病、猝倒病等病害的防治效果。

同样，杀菌剂的类型也会影响二者的协同应用效果。己唑醇、丙环唑和氟菌唑对哈茨木霉的毒性依次降低[25]。广谱性杀菌剂如多菌灵、戊唑醇、苯醚甲环唑对哈茨木霉610 的抑制作用比长枝木霉758 弱[24]。专化性杀菌剂如氰烯菌脂、啶酰菌胺不仅与3 种木霉菌相容性好，联合应用还提高了对水稻恶苗病菌Fusariumfujikuroi的抑菌率[26]。同样嘧菌酯和噻唑锌也能与绿色木霉、长枝木霉和哈茨木霉联合抑制水稻纹枯病菌Rhizoctoniasolani，协同系数达到2.47、3.00 和1.85[17]。双炔酰菌胺分别与棘孢木霉Thz01 和深绿木霉TZ1105 混用后对减少了双炔酰菌胺用量达到25%～35%[27]。啶氧菌酯与哈茨木霉联合对齐整小核菌菌丝的抑菌率为92.11%，显著高于啶氧菌酯对照[18]。哈茨木霉SH2303 和苯甲·丙环唑协同应用后显著降低了玉米小斑病的病斑面积[28]。本试验木霉菌株的防治效果也受到杀菌剂的影响，12 种杀菌剂中代森锰锌与棘孢木霉T16、深绿木霉T15和哈茨木霉T11均具有协同增效作用。噻呋酰胺与棘孢木霉T16和深绿木霉T15具有增效作用。噁霉灵只与棘孢木霉T16具有增效作用，但不同杀菌剂与同一种木霉菌间协同防治效果增长率却各不相同。

此外，木霉菌与杀菌剂在田间的协同防治效果也会受到作物种类、施用方法、土壤营养、微生物多样性、连作年限、病原菌数量等诸多因素的影响，因此为提高木霉菌与噻呋酰胺对北苍术白绢病的防治效果，还需要进一步研究这些因素对木霉菌与噻呋酰胺联合增效作用的影响。