贝莱斯芽孢杆菌DPT-03 对花生白绢病菌的防控效果

彭启超，黄德龙，张志鹏，，魏 浩，吴书凤，吴 妍，李 俊，邓祖科，王宗抗

（1. 北京世纪阿姆斯生物工程有限公司，北京 101200；2. 深圳市芭田生态工程股份有限公司，深圳 518105）

花生是我国主要的油料与经济作物之一，在农业生产和社会生产中占据重要地位，但其生长易受到病虫害的影响，其中白绢病对花生的危害更是呈逐年加重的趋势[1‑3]。在河南、山东、广东、辽宁和江西等花生种植区域均因白绢病造成花生大面积不同程度的减产，严重阻碍了我国花生产业的发展[4]。

花生白绢病菌为半知菌亚门无孢菌目齐整小核菌（Sclerotium rolfsiiSacc），是一种寄主广泛且危害严重的土传性真菌[5‑7]。目前，通过轮作、培育抗性品种以及使用化学药剂防治和防控花生白绢病的效果并不理想，同时长期大量使用农药造成土壤受到污染，农产品质量和安全性下降[8]。生物防治是农业绿色发展的重要方向，利用生防菌防治花生白绢病对花生生产具有重要意义[9‑10]。

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）作为芽孢杆菌属的一个新种，能够产生多种抑菌活性物质，在防治黄瓜霜霉病、马铃薯疮痂病和早疫病等方面具有较好的防效[11‑13]。在花生病害防治上，臧超群等[14]研究表明，贝莱斯芽孢杆菌BP-1能有效抑制花生网斑病菌的生长，在田间试验中对花生网斑病也表现出较好的防治效果；潘梦诗等[15]筛选分离的贝莱斯芽孢杆菌BS-01 能显著抑制花生白绢病菌菌丝生长和菌核生成，在盆栽试验中能明显降低花生白绢病的病情指数。目前，关于贝莱斯芽孢杆菌对花生白绢病的防治研究相对较少，且仅局限于平板对峙和盆栽试验，其对花生白绢病菌的平板抑制、盆栽和大田试验防效的综合研究尚未见报道。鉴于此，以北京世纪阿姆斯生物工程有限公司前期筛选分离得到的一株可抑制番茄灰霉病、番茄枯萎病和棉花枯萎病的贝莱斯芽孢杆菌（命名为DPT-03）为生防菌株，研究其对花生白绢病菌菌丝生长和菌核形成的抑制作用，并采用盆栽试验和田间试验探究了DPT-03 对花生白绢病的防控效果及对花生产量的影响，为花生白绢病生防制剂的研发及应用提供理论和实践依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 花生白绢病菌菌株（Sclerotium rolfsiiSacc）由山东省花生研究所提供。贝莱斯芽孢杆菌DPT-03 菌株由北京世纪阿姆斯生物工程有限公司从土壤中分离并保存。

1.1.2 培养基配制 LB 培养基和PDA 培养基的配制参考方中达[16]的方法。

1.2 方法

1.2.1 DPT-03 菌悬液对花生白绢病菌菌丝生长的影响 将花生白绢病菌接种于PDA 培养基平板中央，28 ℃培养7 d，待病菌长满平板后放于4 ℃冰箱备用。挑取贝莱斯芽孢杆菌DPT-03 单菌落于LB液体培养基中，180 r/min、30 ℃摇床振荡培养24 h备用。将长满花生白绢病菌的平板打孔取直径7.5 mm 菌饼接种到PDA 平板中央，在距离平板中央20 mm处放置已灭菌的直径为6 mm的滤纸片，加入10 μL 活 化 的DPT-03 菌 液，以 在 滤 纸 片 上 加 入10 μL LB 无菌培养液作为对照（CK），28 ℃恒温培养，5 d 和20 d 时对抑菌情况进行统计，每个处理重复3 次。用十字交叉法测量菌落直径，抑菌率＝（CK 菌落增长直径－处理菌落增长直径）/CK 菌落增长直径×100%，菌落增长直径（mm）=菌落直径-7.5。

1.2.2 DPT-03 无菌发酵液对花生白绢病菌菌丝生长的影响 将菌株DPT-03 活化菌液10 000 r/min离心10 min 后收集上清液，用0.22 μm 滤膜过滤得到无菌发酵液。将无菌发酵液与加热冷却至50～55 ℃的PDA 培养基以1∶10 的比例混合后倒平板，以添加等量PDA 培养基的平板为对照（CK），在平板中央接入直径为7.5 mm的白绢病菌菌饼，28 ℃恒温培养，3次重复，5 d和20 d时统计抑菌情况。

1.2.3 DPT-03 挥发性气体对花生白绢病菌菌丝生长的影响 参考张霞等[17]方法，在二分格培养皿两侧各倒入等体积的LB培养基和PDA培养基。LB培养基一侧用DPT-03 菌悬液画线，PDA 培养基侧中间位置接种直径为7.5 mm 的白绢病菌菌饼，以无菌培养液划线作为对照（CK），28 ℃恒温培养，3 次重复，5 d和20 d时统计抑菌情况。

1.2.4 DPT-03 菌悬液、无菌发酵液、挥发性气体对白绢病菌菌核生长的影响 将1.2.1、1.2.2 和1.2.3制备的对峙及CK 平板持续培养至30 d，统计菌核生长数量，3 次重复。菌核抑制率=（CK 菌核数量－处理菌核数量）/CK菌核数量×100%。

1.2.5 DPT-03 防控花生白绢病的盆栽试验 菌株DPT-03 对花生白绢病的盆栽防治效果试验于2020年5—8 月在北京世纪阿姆斯生物工程有限公司作物培养室进行，试验共设4 个处理，每个处理5 盆花生，每盆1株，3次重复，试验盆栽随机摆放，每隔3 d更换摆放位置。处理1：接种白绢病原菌+灌根施用DPT-03 菌悬液（≥1.0×109cfu/mL）20 mL/盆；处理2：接种白绢病原菌+灌根施用DPT-03 无菌发酵液20 mL/盆；处理3：接种白绢病原菌+灌根施用24%噻呋酰胺（240 g/L 噻呋酰胺悬浮剂稀释500 倍）20 mL/盆；处理4（CK）：接种白绢病原菌+灌根施用无菌水20 mL/盆。接种白绢病原菌即直接把病原菌菌饼接种到土壤中，2 d后将DPT-03菌悬液、无菌发酵液、噻呋酰胺和无菌水分别以灌根的方式施用到相应处理的土壤中，接种病原菌后每隔20 d 对花生白绢病发病情况进行调查。白绢病发病程度采用0～4级的分级标准：0级，无症状；1级，仅茎基部产生病害；2级，染病部位占整株的1/3以下；3级，染病部位占整株的2/3 以下；4 级，植株接近或已经死亡。统计各处理花生的发病率、病情指数和防治效果。

发病率=发病株数/调查总株数×100%，

病情指数=∑（各级发病株数×病级数）/（调查总株数×最高病级数）×100，

防治效果=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%。

1.2.6 DPT-03 防控花生白绢病的田间试验 田间试验于2020 年6—10 月在河南省正阳县袁寨镇单茨园村进行，试验田0～20 cm 耕层土壤养分含量为有机质11.78 g/kg、碱解氮61.56 mg/kg、速效磷29.63 mg/kg、速效钾185.26 mg/kg，pH 值为6.21，供试土壤为砂姜黑土，连续多年花生重茬，白绢病发病严重。供试花生品种为远杂9102，225 000穴/hm2，每穴2株。试验分3 个处理：处理1，DPT-03菌悬液（1×109cfu/mL）150 L/hm2，翻地前用农用喷雾器一次性喷入土壤；处理2，于花生苗期（7 月15 日）采用240 g/L噻呋酰胺悬浮剂喷淋花生根茎部，用药量为900 mL/hm2，用水量1 500 L/hm2；处理3，空白对照（CK）。试验采用随机区组排列，3 次重复，小区面积为30 m2（5 m×6 m）。播种后第45 天和第90天调查花生感染白绢病的情况，每处理小区对角线5 点取样，每点15 穴（30 株），统计各处理发病株数，计算防效。花生收获时（10 月2 日），各小区5 点取样，每点4株，晒干荚果后测定花生产量。

发病率=发病株数/调查总株数×100%，

防治效果=（CK 病株率-处理区病株率）/CK 病株率×100%。

1.3 数据处理

采用Excel 2010 软件和SPSS 20.0 进行数据的统计和分析。

2 结果与分析

2.1 DPT-03菌悬液对花生白绢病菌菌丝生长的影响

在平板对峙试验中，贝莱斯芽孢杆菌DPT-03菌悬液对花生白绢病菌菌丝生长具有显著的抑制效果（图1）。由图2 可见，培养5 d 时DPT-03 菌悬液处理的白绢病菌菌落增长直径为8.49 mm，而CK增长直径为29.68 mm，DPT-03 菌悬液对白绢病菌菌丝生长的抑制率达到71.39%；持续培养至20 d时，DPT-03 菌悬液处理白绢病菌菌落增长直径为10.28 mm，CK 增长直径为80.43 mm，抑制率高达87.20%，且抑制率表现出一定的上升趋势。可见，贝莱斯芽孢杆菌DPT-03 菌悬液可以长效且稳定抑制花生白绢病菌菌丝的生长。

图1 DPT-03菌悬液对花生白绢病菌菌丝生长的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of suspension of strain DPT-03 on hyphae growth of Sclerotium rolfsii

图2 DPT-03菌悬液对花生白绢病菌菌丝生长的影响Fig.2 Effect of suspension of strain DPT-03 on hyphae growth of Sclerotium rolfsii

2.2 DPT-03无菌发酵液对花生白绢病菌菌丝生长的影响

贝莱斯芽孢杆菌含有多种抗菌物质合成的关键基因，其代谢物中含有丰富的抗菌活性物质[18]。由图3可以看出，DPT-03无菌发酵液对花生白绢病菌菌丝生长有一定的抑制效果。由图4 可见，培养5 d 时DPT-03 无菌发酵液处理白绢病菌菌落增长直径为12.77 mm，CK 菌落增长直径为29.01 mm，DPT-03 无菌发酵液对花生白绢病菌菌丝生长的抑制率为55.98%；培养20 d 时DPT-03 无菌发酵液处理的白绢病菌菌落增长直径为37.62 mm，CK 为80.50 mm，抑制率达到53.27%。

图3 DPT-03无菌发酵液对花生白绢病菌菌丝生长的抑制效果Fig.3 Inhibition effect of sterile fermentation broth of strain DPT-03 on hyphae growth of Sclerotium rolfsii

图4 DPT-03无菌发酵液对花生白绢病菌菌丝生长的影响Fig.4 Effect of sterile fermentation broth of strain DPT-03 on hyphae growth of Sclerotium rolfsii

2.3 DPT-03挥发性气体对花生白绢病菌菌丝生长的影响

贝莱斯芽孢杆菌DPT-03 挥发性气体对白绢病菌菌丝生长有一定的抑制作用，但效果不明显（图5）。由图6 可见，培养5 d 时，DPT-03 处理白绢病菌菌落增长直径为20.01 mm，CK 增长直径为25.34 mm，DPT-03 挥发性气体对白绢病菌菌丝生长抑制率为20.68%；培养20 d 时，菌株DPT-03 处理的白绢病菌菌落增长直径为50.01 mm，CK 增长直径为54.95 mm，抑制率仅为8.99%，具有一定的下降趋势。从整体效果看，DPT-03 挥发性气体对白绢病菌菌丝生长的抑制率不如其菌悬液和无菌发酵液高。

图5 DPT-03挥发性气体对花生白绢病菌菌丝生长的抑制效果Fig 5 Inhibitory effect of volatile gas of strain DPT-03 on hyphae growth of Sclerotium rolfsii

图6 DPT-03挥发性气体对花生白绢病菌菌丝生长的影响Fig.6 Effect of volatile gas of strain DPT-03 on hyphae growth of Sclerotium rolfsii

2.4 DPT-03菌悬液、无菌发酵液和挥发性气体对花生白绢病菌菌核生长的影响

由表1可知，贝莱斯芽孢杆菌DPT-03的菌悬液和无菌发酵液均能显著抑制白绢病菌菌核的形成。连续培养30 d，菌悬液处理的白绢病菌菌核数量平均是4.33 个，无菌发酵液处理菌核数量为10.33 个，均显著少于其对照。菌悬液和无菌发酵液对白绢病菌菌核的抑制率分别高达88.51%和76.34%，而挥发性气体对白绢病菌菌核的抑制率仅为10.67%，推测贝莱斯芽孢杆菌DPT-03 主要通过分泌抑菌活性物质减少白绢病菌菌核的形成。

表1 DPT-03菌悬液、无菌发酵液、挥发性气体对花生白绢病菌菌核生长的影响Tab.1 Effect of DPT-03 suspension，sterile fermentation broth and volatile gas on sclerotia growth of Sclerotium rolfsii

2.5 DPT-03防控花生白绢病的盆栽试验效果

菌株DPT-03 防控花生白绢病的盆栽试验结果见表2，单独接种白绢病原菌的花生植株发病较早，施用贝莱斯芽孢杆菌DPT-03 菌悬液、无菌发酵液和化学药剂均可推迟花生白绢病的发病时间，降低病情指数。在接种白绢病原菌60 d 时，DPT-03 菌悬液处理防效达到62.50%，优于噻呋酰胺药剂处理（57.14%）和无菌发酵液处理（30.36%）。值得注意的是，无菌发酵液和化学药剂处理对花生白绢病的防效随时间延后均有一定下降趋势，尤其无菌发酵液处理更为明显，而DPT-03 菌悬液对花生白绢病的防效则表现为上升趋势。

表2 DPT-03防控花生白绢病的盆栽试验效果Tab.2 Prevention and control effect of strain DPT-03 on Sclerotium rolfsii in pot culture

2.6 DPT-03对花生白绢病的大田防效及对花生产量的影响

贝莱斯芽孢杆菌DPT-03 在田间防控花生白绢病中仍表现出较好的效果，能有效减少花生白绢病的发病株数。由表3 可见，播种后第45 天，防效为58.77%，略低于噻呋酰胺药剂处理（59.78%），播种后第90 天防效为61.83%，高于噻呋酰胺药剂处理（58.03%）。DPT-03 处理花生产量为5 233.67 kg/hm2，高于噻呋酰胺药剂处理（5 122.22 kg/hm2）和空白对照（4 722.22 kg/hm2），DPT-03 处理花生产量较空白对照增产13.88%，高于噻呋酰胺处理的增产率（8.47%）。

表3 DPT-03对花生白绢病的大田防效及对花生产量的影响Tab.3 The effect of strain DPT-03 on field control of Sclerotium rolfsii and peanut yield

3 结论与讨论

近年来，随着花生种植业结构调整和耕作制度改变，花生白绢病对花生的危害逐年加重，严重影响花生的产量和收益[2]。生物防治具有安全、持效和环保特性，利用生物防治方法防控花生白绢病是目前的研究热点之一[11]。贝莱斯芽孢杆菌是一种新型生防细菌，其代谢产物具有广谱抑菌性，可抑制多种植物病原菌且能促进作物的生长，在生物防治方面具有很大的应用潜力[19‑20]。

曹伟平等[21]筛选分离的贝莱斯芽胞杆菌Hsg1949对花生白绢病菌和果腐病致病镰孢菌具有明显的拮抗作用，在田间试验中能显著降低花生果腐病的发病率。潘梦诗等[15]筛选分离的贝莱斯芽孢杆菌BS-01 对花生白绢病菌具有很好的防控作用，其菌悬液和无菌发酵液均可显著抑制白绢病菌菌丝的生长和菌核的形成。菌丝和菌核是白绢病菌繁衍和侵染花生的重要途径[22]。本研究中，贝莱斯芽孢杆菌DPT-03 的菌悬液对白绢病菌菌丝生长和菌核形成具有明显的抑制作用，培养20 d 白绢病菌菌丝生长抑制率达87.20%，高于潘梦诗等[15]的研究结果（81.93%），培养30 d 时菌核抑制率达到88.51%，低于潘梦诗等[15]的研究结果（100.0%），可能是由于试验环境不同导致的差异。拮抗菌株在室内试验中表现出拮抗作用具有一定应用参考，但在田间复杂环境下依旧能表现出优良的抑菌防效才具有较好的生防应用潜力[23]。夏明聪等[24]研究表明，贝莱斯芽孢杆菌YB-145 在田间应用中对小麦纹枯病具有较好的防效，且具有较好的增产作用。贝莱斯芽孢杆菌不仅可以分泌抑菌活性物质抑制病原菌，还可以分泌吲哚乙酸、玉米素和赤霉素等植物激素促进植物生长[13]。本试验中，将DPT-03菌株应用于田间防治花生白绢病，降低了发病株数，播种后90 d 防效达到61.83%，同时提高了花生产量，进一步说明DPT-03 菌株能够在田间复杂条件下定殖且发挥防病和促生性能。

本试验研究了生防菌株贝莱斯芽孢杆菌DPT-03 对花生白绢病菌菌丝生长、菌核形成，以及对花生白绢病盆栽防效、田间防效及花生产量等的影响，结果表明，DPT-03 能高效抑制花生白绢病菌菌丝生长和菌核形成，在盆栽试验中能降低白绢病的发病率和病情指数，在田间试验中也表现出较好的防效且具有增加花生产量的优势，具备高效防治花生白绢病微生物制剂的开发潜力。有研究表明，贝莱斯芽孢杆菌能通过分泌脂肽类抗生素、聚酮类化合物和抗菌蛋白等产生抑菌作用[20]，接下来将进一步研究DPT-03 菌株抑菌活性物质的主要种类、特性及其稳定性，为开发抗性强、专一且稳定性高的白绢病生防制剂提供理论和实践依据。