两种芽胞杆菌对苗期土传辣椒疫病的防控作用

祝文慧，秦 溥，赵 岩，殷 辉，任 璐，周建波

（山西农业大学植物保护学院，太谷 030801）

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌PhytophthoracapsiciLeonian 引起的一种危害严重的世界性土传病害，在辣椒整个生育期均可发生。移栽苗带菌是辣椒疫病发生面积不断增大的重要因素。育苗室穴盘育苗是辣椒的主要育苗方式[1]，但育苗室中温差小、湿度高等特殊环境条件，导致育苗时疫霉菌易在育苗土中大量增殖，形成带菌苗，甚至造成大量病株和死苗[2-3]，因此辣椒育苗期疫病的预防是控制辣椒疫病田间发生的重要措施。

生防菌防治植物病害具有对环境无污染、对人畜无毒害、病原菌不产生抗药性等优点，已成为植物病害防控研究热点之一。已有多种辣椒疫霉生防菌的报道，部分生防菌兼具拮抗和促生作用，大多数生防菌是从根际土壤中分离得到的[4]。芽胞杆菌除具有较好的防病效果以外，还因其促进植株生长、增加植物抗逆性等优势特征而被广泛研究和应用[5]，已报道出枯草芽胞杆菌B.subtilis[6]、解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens[7]、多粘类芽胞杆菌Paenibacilluspolymyxa[8,9]等喷雾或灌根防控辣椒疫病，且防控效果较好，但生防菌浸种或包衣防治辣椒疫病鲜见报道。贝莱斯芽胞杆菌[10]和蜡样芽胞杆菌[11]近年来也应用于辣椒疫病的防控，但这两种生防菌在浸种防治辣椒疫病中的应用较少。生防菌的单一使用存在作用方式单一、见效慢、稳定性和持久性差等缺点[12]，生防菌混合使用和化学药剂生防菌剂联合使用是提高生防菌利用效果的重要方式。国内外已对生防菌混合使用、菌药联用防控真菌病害展开了广泛深入的研究，但对辣椒疫病防控的研究较少。本研究测定了贝莱斯芽胞杆菌LYK10 与蜡样芽胞杆菌QTK2 浸种对辣椒苗期疫病的防控效果，分析了两种生防菌的防病作用方式，研究了两种供试生防菌混合及贝莱斯芽胞杆菌LYK10 与烯酰吗啉联合浸种对辣椒苗期疫病的防治效果，以期为辣椒疫病生物防治和生防菌有效利用研究提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

病原菌辣椒疫霉菌BY1、两种生防菌贝莱斯芽胞杆菌LYK10 和蜡样芽胞杆菌QTK2 均由山西农业大学植物保护学院植物病害研究室分离、纯化、鉴定和保存；中椒108 号，甜椒品种，中国农业科学院蔬菜花卉研究所育成；育苗基质，青州市施可壮育苗基质，市售品；烯酰吗啉（98.5%原药），广东中迅农科股份有限公司提供；NA 培养基、NB 培养基、PDA 培养基，OA 培养基的配制均参照郑小波[13]的方法；PA 培养基配方为方椒汁200 g，琼脂 20 g，定容至1000 mL，pH 7.0。

1.2 辣椒疫霉菌孢子悬浮液的制备

将辣椒疫霉菌BY1 接种于OA 平板25 ℃下培养5 d 后，转接于PA 平板25 ℃下培养，每天观察辣椒疫霉的产孢情况。待辣椒疫霉大量产孢时用10 mL 无菌水洗脱孢子。使用血球计数板计数孢子量，菌悬液8000 r/min 离心10 min，去除上清液，无菌水稀释制成104孢子/mL 孢子悬浮液备用。

1.3 LYK10 与QTK2 对辣椒幼苗疫病的防控作用

1.3.1 LYK10 与QTK2 菌悬液的制备 将NA 平板培养的生防菌LYK10、QTK2 接种于NB 培养液，26 ℃、160 r/min 振荡培养24 h，得到种子菌液；取2 mL 种子菌液于200 mLNB 培养液中，26 ℃、160 r/min 振荡培养48 h，将菌液8000 r/min 离心10 min，去掉上清液，用无菌水稀释菌体分别得到浓度为108cfu/mL、107cfu/mL LYK10、QTK2 菌悬液，振荡混匀备用。

1.3.2 带菌基质、无菌基质的制备 将制备好的辣椒疫霉菌孢子悬浮液均匀混入细沙中，再将带菌细沙与育苗基质以1:9 的体积比混合，基质的带菌量为103孢子/L。无菌细沙与育苗基质以1:9 的体积比混合制成无菌基质。

1.3.3 LYK10 与QTK2 单独浸种对辣椒出苗和对疫病的防治效果 分别使用浓度为108cfu/mL 生防菌LYK10、QTK2 菌悬液浸泡无菌辣椒种子4 h 穴盘育苗，以无菌水浸种作为对照处理，每个处理72 株，3 次重复。播种后40 d 每天观察记录各处理辣椒总株数及病株数，统计出苗率、病株率，并以播种后40 d病株率计算防治效果。

1.3.4 LYK10 与QTK2 对辣椒疫霉菌的拮抗作用 采用平板对峙法滤纸片法。在培养基中央接种疫霉菌BY1 菌饼，以平板中心为交点画十字距中心20 mm 处贴5 mm 灭菌滤纸片，每个培养皿贴3 片，108cfu/mL生防菌菌液取5 µL 滴加于滤纸片上。每个菌株重复3 次，计算抑制率。抑制率（%）＝（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100。

1.3.5 LYK10 与QTK2 浸种对辣椒幼苗疫病的促生作用及诱导生理抗性作用 108cfu/mL 生防菌LYK10与QTK2 菌悬液浸泡无菌辣椒种子4 h，分别于含疫霉菌量为103孢子/dm3的基质和无菌基质中穴盘育苗，以无菌水浸种作为对照处理。每个处理72 株，3 次重复。播种后40 d 于穴盘中采集辣椒植株样品，每个处理随机采样10 株，测量单株平均地上部分长度、地下部分的长度和苗重；测定辣椒幼苗过氧化氢酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）活性，酶活性测定均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒完成。CAT酶活性计算方法：组织中CAT 活力（U/mgprot）=ΔA×271/V 样/T/Cpr，其中271 为常数（斜率的倒数），V 样为取样量0.025 mL，T 为反应时间60 s，Cpr 为匀浆蛋白浓度3.1303 mgprot/mL（prot 指蛋白）。PPO酶活性计算方法：PPO 活力（U/g 鲜重）=ΔA/0.01×V 提取液/W×V 反总/V 样×1 mL/V 反总/T，其中V提取液为提取液总体积10 mL，W 为样本鲜重1 g，V 为总反应体系总体积0.9 mL，V 样为取样量0.15 mL，T 为反应时间10 min。

1.4 LYK10 与QTK2 混合浸种对辣椒幼苗疫病的防控作用

将浓度为108、107cfu/mL 生防菌LYK10 与QTK2 菌悬液等浓度等体积混合后，浸泡无菌辣椒种子，时长4 h，浸泡后种植于含疫霉菌量为103孢子/L 的基质中，以无菌水浸种作为对照处理，每个处理72 株，3 次重复。播种后每天观察记录各处理辣椒总株数及病株数，统计出苗率、病株率，并以播种后40 d 病株率计算防治效果。

1.5 烯酰吗啉与生防菌LYK10 相容性测定

将生防菌LYK10 加入NB 培养液，26 ℃、160 r/min 振荡培养24 h 制成种子液。取2 mL 种子液加入200 mL NB 培养液中，26 ℃、160 r/min 振荡培养24 h 得到生防菌液。分别配制浓度为3000、1500 µg/mL烯酰吗啉溶液，与NA 培养基以1:9 比例混合，制成含药培养基。将菌液稀释涂布于培养皿中，3 d 后记录菌落数量。以加无菌水的NA 培养基为对照，每个处理重复3 次。

1.6 LYK10 与烯酰吗啉混合浸种对辣椒幼苗疫病的防控作用

用丙酮溶解98.5%的烯酰吗啉原药，配制成浓度为10 mg/mL 的母液，用无菌水分别稀释成600、300µg/mL 溶液。将浓度为108cfu/mL 生防菌LYK10 菌悬液与600 µg/mL 烯酰吗啉溶液等体积混合制成5.0×107cfu/mL＋300 µg/mL 菌药联用处理；将浓度为107cfu/mL 生防菌LYK10 菌悬液与300 µg/mL 烯酰吗啉溶液等体积混合制成5.0×106cfu/mL＋150 µg/mL 菌药联用处理。将无菌辣椒种子分别在5.0×107cfu/mL＋300 µg/mL 菌药混合溶液、5.0×106cfu/mL＋150 µg/mL 菌药混合溶液、108cfu/mL LYK10 菌液、300 µg/mL 烯酰吗啉溶液中浸泡4 h，种植于带菌基质中，以无菌水浸种作为对照。每个处理72 株，3次重复。播种后每天观察记录各处理辣椒总株数及病株数，统计出苗率、病株率，并以播种后40 d 病株率计算防治效果。

1.7 数据统计与分析

利用Microsoft Excel 2010 进行标准差分析并绘制图表；采用 SPSS Statistics 26.0 软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 LYK10 与QTK2 浸种对辣椒幼苗疫病的防控作用

2.1.1 LYK10 与QTK2 单独浸种、混合浸种对辣椒出苗的影响 两种生防菌LYK10 与QTK2 均对辣椒出苗时间无影响，均为播种后第11 d 开始出苗。如表1 所示，108cfu/mL LYK10 与QTK2 处理的出苗率分别为86.11%、87.50%，108cfu/mL 混合菌液处理、107cfu/mL 混合菌液处理的出苗率分别为86.11%、87.50%，分别相比于清水处理出苗率分别提高1.39%和2.78%，2 种生防菌单独、混合浸种均促进辣椒出苗，各处理之间没有差异性。

表1 LYK10 与QTK2 单独浸种、混合浸种后辣椒幼苗出苗率Table 1 Seedling rate of pepper seedlings after separate and mixed LYK 10 and QTK 2

2.1.2 LYK10 与QTK2 单独浸种、混合浸种对辣椒幼苗疫病的防治效果 如表2 所示，播种后40 d，108cfu/mL LYK10 处理的病株率为18.06%，防效为30.55%，108cfu/mL QTK2 处理的病株率与CK 处理有显著差异，12.50%，防效为33.33%，108cfu/mL 混合菌液处理的病株率为16.67%，防效为42.59%，相比于108cfu/mL QTK2 处理与108cfu/mL LYK10 处理防效分别提高39.41%和27.78%；107cfu/mL 混合菌液处理的病株率与CK 处理间有显著差异，为12.50%，防效为43.52%，相比于108cfu/mL QTK2 处理与108cfu/mL LYK10 处理防效分别提高42.45%和30.57%，各处理防效之间没有差异性。

表2 LYK10 与QTK2 单独浸种、混合浸种后辣椒幼苗病株率及防效Table 2 Disease rate and control effect of LYK10 and QTK2 in pepper seedlings after separate and mixed immersion

LYK10 和QTK2 菌液单独浸种和混合浸种与CK 相比，均可延迟辣椒幼苗发病时间，LYK10 和QTK2菌液浸种可分别延迟5、2 d，108、107cfu/mL 混合菌液处理可分别延迟6、9 d（图1）。

图1 LYK10 与QTK2 单独浸种、混合浸种后辣椒幼苗发病动态Fig.1 Pathogenesis dynamics of pepper seedlings after LYK10 and QTK2 were immersed separately and mixed

2.1.3 LYK10 与QTK 对辣椒疫霉菌的拮抗作用 如图2 所示，LYK10 和 QTK2 对疫霉菌BYI 均有较好的拮抗效果，两种生防菌与疫霉菌间存在明显的抑菌圈；抑菌率分别为67.58%和66.97%（表3）。

表3 108 cfu/mL LYK10 和QTK2 对疫霉菌BY1 的拮抗效果Table 3 Antagonism effect rate of LYK10 and QTK2 at the concentration of 108 cfu/mL against BY1

2.1.4 LYK10 与QTK2 单独浸种对辣椒幼苗疫病的促生作用 试验结果表明，生防菌LYK10 和QTK2 单独浸种后播种40 d 平均株高相比CK 株高提高了4.56%、4.77%，说明2 个生防菌株对辣椒地上部分生长有一定的促进作用，各处理间差异不显著；生防菌LYK10 和QTK2 浸种处理根长相比CK 分别提高了23.50%、20.22%，处理间差异不显著；生防菌LYK10 与QTK2 单株苗重与对照处理相当，处理间差异不显著（图3）。

图3 LYK10 与QTK2 单独浸种对辣椒幼苗株高、根长、苗重的影响Fig.3 Effects of pepper seedling on plant height, root length, and seedling weight after seed immersion between LYK10 and QTK2 alone

2.1.5 LYK10 与QTK 对辣椒幼苗疫病的诱导生理抗性作用 LYK10 处理后辣椒幼苗CAT、PPO 酶活性如图4 所示，无菌基质LYK10 处理的CAT 酶活力要略低于无菌基质清水处理的酶活力，但是带菌基质LYK10 处理的CAT 酶活力要高于无菌基质LYK10 处理的酶活力，说明无病条件下生防菌LYK10 不能诱导辣椒幼苗CAT 酶活提高，而在有菌条件下生防菌LYK10 可以一定程度上诱导植物提高CAT 活性，消除辣椒疫霉菌侵染过程中产生的活性氧，提高辣椒的抗病性。

图4 生防菌LYK10 浸种对辣椒幼苗过氧化氢酶、多酚氧化酶酶活力的影响Fig.4 Effect of LYK10 on catalase and polyphenols oxidase activity in pepper seedlings

带菌基质LYK10 处理的PPO 酶活力低于带菌清水处理的酶活力，带菌基质LYK10 处理的PPO 酶活力低于无菌基质LYK10 处理的酶活力，无菌条件下PPO 活性有所提高，但是有菌条件下生防菌LYK10的存在使得辣椒植株体内PPO 活性降低。

由图5 可知，无菌基质QTK2 处理的CAT 酶活力要略低于无菌基质清水处理的酶活力，但是带菌基质QTK2 处理的CAT 酶活力要分别高于无菌基质QTK2 处理的酶活力，说明无病条件下生防菌QTK2 不能诱导辣椒幼苗CAT 酶活提高，而在有菌条件下生防菌QTK2 可以一定程度上诱导植物提高CAT 活性，消除辣椒疫霉菌侵染过程中产生的活性氧，提高辣椒的抗病性。

图5 生防菌QTK2 浸种对辣椒幼苗过氧化氢酶、多酚氧化酶酶活力的影响Fig.5 Effect of QTK2 on catalase and polyphenols oxidase activity in pepper seedlings

无菌基质QTK2 处理的PPO 酶活力低于无菌基质清水处理和带菌基质QTK2 处理的酶活力，说明无菌条件下生防菌QTK2 没有诱导辣椒植株体内PPO 活性增高。

2.2 烯酰吗啉对生防菌LYK10 生长的影响

经烯酰吗啉处理的菌落数与CK 相当，处理间差异不显著，烯酰吗啉对生防菌LYK10 的生长无影响（图6），二者相容性较好。

图6 LYK10 与烯酰吗啉混合浸种后辣椒幼苗发病动态Fig.6 Dynamic of pepper seedlings after mixing of LYK10 with allylmorpholine

图6 烯酰吗啉对生防菌LYK10 生长的影响Fig.6 Effects of dimethomorph on the growth of biocontrol bacteria LYK10

2.3 LYK10 与烯酰吗啉混合浸种对辣椒幼苗疫病的防控作用

2.3.1 LYK10 与烯酰吗啉混合浸种对辣椒出苗的影响 试验结果表明，生防菌LYK10 和烯酰吗啉浸种处理后对辣椒出苗时间无影响，均为11 d 开始出苗。播种40 d 时，5.0×107cfu/mL＋300 µg/mL 菌药混合处理、5.0×106cfu/mL＋150 µg/mL 菌药混合处理的出苗率分别为86.11%和91.67%，相比于CK 出苗率分别提高1.39%和6.95%；5.0×107cfu/mL＋300 µg/mL 菌药混合处理相比300 µg/mL 烯酰吗啉处理提高1.39%；5.0×106cfu/mL＋150 µg/mL 菌药混合处理的出苗率比108cfu/mL LYK10、300 µg/mL 烯酰吗啉的出苗率分别提高5.56%和6.95%，各处理之间没有显著差异性（表4）。

表4 LYK10 与烯酰吗啉混合浸种后辣椒幼苗出苗率Table 4 Seedrate of pepper seedlings after mixing LYK10 with allylmorpholine

2.3.2 LYK10 与烯酰吗啉混合浸种对辣椒幼苗疫病的防治效果 试验结果表明，5.0×107cfu/mL＋300 µg/mL菌药混合处理、5.0×106cfu/mL＋150 µg/mL 菌药混合处理相对于CK 处理辣椒发病时间分别延迟了4 和6 d（如图6 所示）。由表5 可知，播种后40 d，5.0×107cfu/mL＋300 µg/mL 菌药混合处理的病株率为13.89%，防效为48.15%，相比于108cfu/mL LYK10 处理与300 μg/mL 烯酰吗啉处理防效分别提高57.61%和20.95%；5.0×106cfu/mL＋150 µg/mL 菌药混合处理的病株率为16.67%，防效为38.89%，相比于108cfu/mL LYK10处理防效提高27.30%，相比于300 μg/mL 烯酰吗啉处理防效降低2.31%，5.0×107cfu/mL＋300 µg/mL 菌药混合浸种处理与108cfu/mL LYK10 浸种的防效之间有差异性，5.0×107cfu/mL＋300 µg/mL 菌药混合浸种处理防病效果最佳。

表5 LYK10 与烯酰吗啉混合浸种后辣椒幼苗病株率及防效Table 5 Plant rate and efficacy of pepper seedlings after mixing LYK10 with allylmorpholine

3 讨论

种苗带菌是植物病害远距离传播的重要方式，特别是对于土传病害，不仅会直接造成发病危害，还会在种植田土壤中进行病原积累，成为病害发生的潜在菌源。辣椒疫病是世界性的土传和种传病害，移栽种植模式下种子带菌和育苗土带菌均可导致种苗带菌[14]。本试验在育苗土103孢子/L 接菌条件下，辣椒疫病发病率为26.39%，其他无症带菌辣椒种苗则会成为辣椒疫病大面积发生的病原菌初侵染源，因此育苗期辣椒疫病预防是防止辣椒疫病扩散的重要措施。应用生防菌浸种防治辣椒疫病可同时预防种子带菌形成带菌种苗，还可降低带菌育苗土中病原菌数量，同时通过生防菌在辣椒苗植株内和根基土中的定殖以预防和降低定植后田间辣椒疫病的发生。

贝莱斯芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌均为革兰氏阳性芽胞杆菌，具有植物促生长、生物防治等功能。贝莱斯芽胞杆菌防治植物病害应用较为广泛，在马铃薯早疫病[15]、马铃薯晚疫病[16]、水稻稻瘟病[17]、香蕉枯萎病[18]、橄榄黄萎病[19]等病害防治中已有报道，蜡样芽胞杆菌在线虫病害防治方面的应用比较广泛[20,21]。张德珍等[10]用贝莱斯芽胞杆菌F1-1 发酵液灌根研究对辣椒疫病的防治效果，防效达到69.91%；邹修为等[22]用贝莱斯芽胞杆菌Y4-39 发酵液灌根防治辣椒疫病，结果表明该菌株具有良好的防治效果。本试验采用供试生防菌浸种方式防治育苗期土传辣椒疫病，两种供试菌株均延迟了辣椒幼苗发病时间，降低了病株率。两种生防菌菌液浸种对辣椒苗期防效在30%左右，防效低的原因可能与菌液浸种后种子表面带菌量少相关，生防菌制剂化包衣可增加单粒种子表面带菌量，是提高防治效果的有效途径，因此生防菌制剂化研究也是生防菌有效利用的重要措施。

芽胞杆菌防病机理主要包括竞争作用、拮抗作用、促生作用和诱导抗性作用等[23]。本试验结果表明LYK10 与QTK2 对辣椒植株有一定的促生作用，但效果不显著，可能是由于在试验育苗期短，供试菌株的促生作用未完全发挥。两种供试生防菌株对辣椒疫霉菌存在拮抗作用，存在明显的抑菌圈，说明两种供试菌株可产生在培养基中扩散的抑菌物质。CAT 在阻止或减少羟基自由基以及清除超氧自由基、H2O2和过氧化物等方面发挥重要作用，可以通过一系列防御机制来保护植物细胞；PPO 在植物遭到病原物侵袭时，能氧化体内的多酚类物质生成醌类物质，而醌类物质对多种病原物有毒害作用[24]。有菌条件下生防菌LYK10 与QTK2 可以一定程度上诱导植物提高CAT 活性，消除辣椒疫霉菌侵染过程中产生的活性氧，提高辣椒的抗病性。生防菌LYK10 的存在一定程度上可以提高辣椒植株体内PPO 活性，但是作用不明显，生防菌QTK2 则没有诱导PPO活性提高可能是由于酶活性处于动态变化，没有检测到峰值。LYK10与QTK2诱导防御酶活性变化动态、产生的代谢物类型及生防机制还需要继续研究。

生防菌混合使用即充分利用不同生防菌之间的协同增效作用，增加防治谱，提高防治效果及其稳定性，是生防菌利用的的研究热点。杨瑞先等[25]试验结果表明解淀粉芽胞杆菌 Fy11 和 Zy44 混合与单菌株相比显著降低辣椒疫霉发生的严重度；杨定祥[26]用海洋木霉菌和海洋解淀粉芽胞杆菌防控辣椒疫病，2 菌株混合使用较单一菌株处理发病率分别降低了38.71%、42.42%。本试验结果表明，贝莱斯芽胞杆菌LYK10 与蜡样芽胞杆菌QTK2 混合浸种防效高于LYK10 与QTK2 单独浸种的防效，并且低浓度混合菌液处理的防效高于高浓度生防菌联合使用的防效。这可能是由于高浓度的混合菌液之间产生的抑制作用大于低浓度的混合菌液，需继续进行生防菌联合使用最佳配比筛选试验。

生防菌与化学药剂联合使用是生防菌有效利用的另一个有效措施，该方法充分利用生防菌的持效性和化学药剂的速效性，从而有效控制有害生物的危害。冯永新等[27]探究短小芽胞杆菌和化学杀菌剂协同防治烟草青枯病效果，结果表明菌药复配剂的防效（68.77%）明显优于单剂噻菌铜和生防菌AR03 的防效，且混配剂中噻菌铜使用量只有单剂的1/2，大幅降低了化学药剂的使用量；黄大野等[28]将淡紫褐链霉菌NBF715 和烯酰吗啉联合使用进行辣椒疫病防控盆栽试验，防效提高且减少了烯酰吗啉的使用量；枯草芽胞杆菌与氟环唑联用对禾谷镰孢霉的增效作用，结果表明：菌药联用对禾谷镰孢霉的最高抑菌活性可达74.44%，表现增效和持效作用[29]。本试验利用贝莱斯芽胞杆菌LYK10 与烯酰吗啉混合浸种防治育苗期土传辣椒疫病，2 个菌药联用处理的防效均高于其高浓度单菌和单药对照处理，达到了减药增效的效果，但应继续进行菌药配比筛选及辣椒疫病全程防控技术研究，充分利用生防菌资源防控辣椒疫病。