类球红细菌对农药的耐受性研究

2023-12-25郑绪瑞章海鑫曹海鹏

江西水产科技 2023年5期

郑绪瑞章海鑫曹海鹏

文章编号：1006-3188（2023）05-011-03

摘要：为评价类球红细菌对农药的耐受性，本实验采用牛津杯法测定类球红细菌对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟硅唑、苯醚甲环唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井冈·己唑醇、苯甲·丙环唑、联菊·啶虫脒、烯酰·氰霜唑、虱脲·虫螨腈等10种农药的敏感性，进而采用试管二倍稀释法测定了类球红细菌对敏感农药的耐受剂量。结果表明，类球红细菌对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟硅唑、苯醚甲环唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井冈·己唑醇、苯甲·丙环唑耐药，对虱脲·虫螨腈、联菊·啶虫脒、烯酰·氰霜唑高度敏感；虱脲·虫螨腈、联菊·啶虫脒和烯酰·氰霜唑对类球红细菌的MIC和MBC分别为48.83 mg/L和97.65 mg/L、195.31 mg/L和195.31 mg/L、195.31 mg/L和195.31 mg/L。本实验结果为养殖水体中的农药残留对类球红细菌的影响评价奠定基础。

关键词：类球红细菌；农药；敏感性；耐受剂量

中图分类号：S948 文献标识码：A

类球红细菌（Rhodobactersphaeroides）是一种具有良好解毒性能光合细菌［1］。曹海鹏等［2］研究表明，类球红细菌能够将敌百虫对斑马鱼的LD50从26.06 mg/L提升至59.51 mg/L，表现出对降低敌百虫良好的解毒效果。近年来，随着农业生产规模的扩大，投入使用的农药逐渐增多，农药污染养殖水体环境的问题日益突出［3，4］。然而，养殖水体中的农药残留是否影响类球红细菌尚不清晰。鉴此，本实验采用牛津杯法测定了类球红细菌对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟硅唑、苯醚甲环唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井冈·己唑醇、苯甲·丙环唑、联菊·啶虫脒、烯酰·氰霜唑、虱脲·虫螨腈等10种农药的敏感性，进而采用试管二倍稀释法测定了类球红细菌对敏感农药的耐受剂量，以期为养殖水体中的农药残留对类球红细菌的影响评价奠定基础。

1 材料方法

1.1 实验材料

类球红细菌XR12，由本实验室从养殖污泥中分离、鉴定并保存［2］；虱脲·虫螨腈（有效成分12％）、井冈·己唑醇（有效成分11％）、氟硅唑（有效成分10％）、苯甲·嘧菌酯（有效成分30％）、腐霉利（有效成分50％）、苯醚·甲环唑（有效成分10％）、苯甲·丙环唑（有效成分30％）、联菊·啶虫脒（有效成分6％）、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（有效成分5％）、烯酰·氰霜唑（有效成分40％），所有药物均为国内公司生产。营养琼脂平板、红细菌液体培养基［5］、含4 mL红细菌液体培养基的带帽试管30根、含2 mL红细菌液体培养基的带帽试管600根，均在121°C灭菌20 min，备用。

1.2 类球红细菌菌悬液的制备

将类球红细菌在无菌环境下接种于灭菌后的红细菌液体培养基，置于恒温光照摇床中培养48h，温度30℃，转速180 r/min；之后10000 r/min离心去除上清液，加入无菌水得到菌悬液，通过MPN5管法［6］测定菌悬液活菌含量并用无菌水稀释至浓度为1.0×107 CFU/mL。

1.3 类球红细菌对农药的敏感性分析

采用牛津杯法［7］测定类球红细菌对农药的敏感性。无菌操作将107 CFU/mL类球红细菌菌悬液0.2 mL均匀涂布营养琼脂平板，然后在涂有类球红细菌的营养琼脂平板上放置无菌牛津杯，接着在每个牛津杯中分别加入0.2 mL浓度为10000 mg/L的甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟硅唑、苯醚甲环唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井冈·己唑醇、苯甲·丙环唑、联菊·啶虫脒、烯酰·氰霜唑、虱脲·虫螨腈药液，然后于30℃恒温正置培养48 h，测量抑菌圈直径（d）。d＞15 mm为高度敏感，10 mm＜d≤15 mm为中度敏感，d≤10 mm为耐药。每个处理设3个平行。

1.4 类球红细菌对农药的耐受剂量分析

采用试管二倍稀释法测定类球红细菌对1.3节筛选的敏感农药的耐受剂量。试验前无菌操作分别将联菊·啶虫脒、烯酰·氰霜唑、虱脲·虫螨腈0.1 mL加入含4 mL无菌红细菌液体培养基的试管中至质量浓度为25000 mg/L，混合均匀后再无菌操作从质量浓度为25000 mg/L的试管中吸取2 mL至含2 mL紅细菌液体培养基的试管中使质量浓度为12500 mg/L，混合均匀后再无菌操作从质量浓度为12500 mg/L的试管中吸取2 mL至含2 mL红细菌液体培养基的试管中使质量浓度为6250 mg/L，依次操作将敏感农药稀释成3125、1562.5、781.25、390.63、195.31、97.65、48.83、24.41、2.21、6.10、3.05、1.53、0.76、0.38、0.19、0.10 mg/L，同时以含2 mL无菌红细菌液体培养基的试管作为空白对照。无菌操作接种类球红细菌菌悬液至含不同质量浓度敏感农药的试管中使菌终浓度5.0×105 CFU/mL，然后于恒温振荡培养箱30℃培养48h后，以肉眼观察结果，把无浑浊现象、稀释度最大的质量浓度作为敏感农药对类球红细菌的最小抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration，MIC）。在此基础上，进一步从无菌生长的试管中取0.2 mL培养液在营养琼脂平板上涂布，然后将平板置于30℃恒温培养48h，观察有无菌落形成。把无菌落形成的、稀释度最大的质量浓度作为敏感农药对类球红细菌的最小杀菌浓度（Minimum bactericidal concentration，MBC）。每个处理设3个平行。

1.5 数据处理与分析

所有实验数据采用 SPSS 19.0 软件进行处理分析，以平均值±标准差表示。

2 实验结果

2.1 类球红细菌对农药的敏感性

实验结果（表1）表明，虱脲·虫螨腈、联菊·啶虫脒、烯酰·氰霜唑对类球红细菌具有明显抑菌活性（图1），其对类球红细菌的抑菌圈直径分别为22.33、25.67、19.67 mm，说明类球红细菌对虱脲·虫螨腈、联菊·啶虫脒、烯酰·氰霜唑具有高度敏感性。甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟硅唑、苯醚甲环唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井冈·己唑醇、苯甲·丙环唑对类球红细菌的抑菌圈直径小于10 mm，说明类球红细菌对其不敏感。

2.2 类球红细菌对农药的耐受剂量

实验结果（表2）表明，联菊·啶虫脒、烯酰·氰霜唑、虱脲·虫螨腈对类球红细菌的MIC分别为195.31、195.31、48.83 mg/L，对类球红细菌的MBC分别为195.31、195.31、97.65 mg/L。

3 讨论

相关研究［8］表明，光合细菌对农药的敏感性具有一定的差异性。苏亮等［9］证明沼泽红假单胞菌对养殖水体中残留的阿维毒、百草枯等农药敏感，对辛硫磷和灭多威等农药耐药。本实验结果表明，类球红细菌对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟硅唑、苯醚甲环唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井冈·己唑醇、苯甲·丙环唑不敏感；对虱脲·虫螨腈、联菊·啶虫脒和烯酰·氰霜唑高度敏感。光合细菌对农药敏感性的差异可能与其具有分解利用农药的能力有关［10］。

近年来，有机氯、有机磷、菊酯类等农药残留在水产养殖水体中均被检出［11-13］，水产养殖水体已经面临了农药残留污染问题。目前，有的残留农药对益生菌的抑制作用已经被证实。例如，蓝俊虹等［14］研究发现喹烯酮在≥25 mg/L时对丁酸梭菌具有抑制作用，在≥50 mg/L时对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌具有抑制作用。然而，农药残留对类球红细菌的影响未有报道，本研究证实类球紅细菌对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟硅唑、苯醚甲环唑、腐霉利、苯甲·嘧菌酯、井冈·己唑醇、苯甲·丙环唑耐药，对虱脲·虫螨腈、联菊·啶虫脒、烯酰·氰霜唑农药高度敏感；虱脲·虫螨腈、联菊·啶虫脒和烯酰·氰霜唑对类球红细菌的的MIC和MBC分别为48.83 mg/L和97.65 mg/L、195.31 mg/L和195.31 mg/L、195.31 mg/L和195.31 mg/L，可作为养殖水体中这些农药残留对类球红细菌影响的风险评估依据。

参考文献

［1］王栋.水产养殖不可或缺的益生菌——类球红细菌［J］.科学养鱼，2015（8）：92-92.

［2］曹海鹏，张书萌，虞晶晶，等.类球红细菌XR12的分离、鉴定及其解毒效果研究［J］.水生生物学报，2020，44（1）：59-66.

［3］邓旺明，李浩瑜，雷鑫，等.南美白对虾近海养殖水体污染现象与分析［J］.广东化工，2017，44（9）：186-187，195.

［4］孙秀梅，程鑫，金衍健，等.淡水养殖环境中除草剂类农药残留量及风险分析［J］.浙江海洋大学学报（自然科学版），2017，36（4）：355-359.

［5］曹海鹏，张书萌，安健，等.一种类球红细菌的发酵培养基及其在类球红细菌的发酵生产中的应用［P］.上海市：CN108220203B，2021-03-02.

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［9］苏亮，程千川，罗小松，等.养殖水体中残留农药对光合细菌生长影响的研究［J］.畜牧与兽医，2014，46（7）：69-73.

［10］郭冉冉，向少能，夏婷，等.光合细菌对氯氰菊酯的降解作用［J］.四川农业大学学报，2009，27（4）：471-474.

［11］张敬卫，宋超，方龙香，等.云南红河哈尼梯田稻鱼共作环境中有机氯农药残留现状及其生态风险评价［J］.农业资源与环境学报，2018，35（5）：412-421.