基于MAPK/NF-κB 通路探究藏红花素对幼年小鼠肺炎模型的治疗作用及分子机制*

董丽君，周波，杨翠玲，李志远，张永峰

（1．潍坊医学院临床医学院，潍坊 261053；2．安丘市人民医院影像科，安丘 262199；3．安丘市人民医院儿科，安丘 262199；4．山东中医药大学中医学院，济南 250355；5．潍坊医学院附属医院儿科，潍坊 261035）

肺炎是一种常见的下呼吸道疾病，主要由病毒感染、细菌或真菌病原体引起，在世界范围内具有较高的发病率和病死率[1]。肺炎广泛发病于儿童中，主要是由于儿童免疫力低下和呼吸道解剖结构的缺陷，其高发病率和复发率可引起各种严重并发症和预后不良，严重影响儿童发育和生命健康[2]。因此，确定儿童肺炎的潜在发病机制，开发新的治疗策略来抑制肺炎的进展非常重要。革兰氏阴性菌中的脂多糖（LPS）是一种有效的炎症内毒素，可导致各种器官如肺部炎症性疾病的发生，LPS 通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/核因子-κB（NF-κB）通路来促进和扩增炎症介质的表达，而过度的炎症浸润导致肺炎进一步加重[3]。研究发现，通过下调NF-κB/MAPK 通路可减弱急性肺炎体外模型的炎症反应[4]。藏红花素（CRO）具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗细胞凋亡和心脏保护等多种生物活性，CRO对肺纤维化大鼠模型中的肺部炎症和肺血管功能障碍有减轻作用[5]。CRO 还能通过抑制p38 MAPK/NF-κB 信号通路发挥对脓毒症诱导的肝、肾和肺损伤的保护作用[6]。而CRO 能否通过调节MAPK/NFκB 信号通路发挥幼年肺炎小鼠的保护作用，尚不清楚。本研究通过构建幼年小鼠肺炎模型，探究CRO的治疗作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF 级C57BL/6 小鼠80 只，购自武汉贝赛模式生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（鄂）2022－0029，3～4 周龄，适应性喂养1 周，饲养环境温度 22 ℃左右，湿度 55%，12 h 光暗循环，不禁水食。本研究通过动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器 CRO（纯度≥98%）、白细胞介素（IL）-1β 酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）；LPS、髓过氧化物酶（MPO）（北京索莱宝公司）；地塞米松（DEX，福州海王福药制药有限公司）；MAPK 激活剂（Anisomycin，美国MedChemExpress 公司）；ELISA 试剂盒：肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6（上海酶联生物公司）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（上海翌圣生物公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、吉姆萨染色试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）；二抗辣根酶标记山羊抗兔（美国Abcam 公司）；一抗p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、核因子κB 抑制蛋白α（IκBα）和β-actin 抗体（赛默飞世尔科技公司）。全自动酶标仪（奥地利TECAN 公司）；显微镜（日本尼康公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠分组、建模和药物干预 将小鼠随机分为对照组、模型组、DEX（阳性对照）组、CRO 低剂量组、CRO 中剂量组、CRO 高剂量组、Anisomycin 组（CRO 高剂量+MAPK 激活剂Anisomycin），每组10 只。其中 DEX 组小鼠以2 mg/kg 灌胃[7]，CRO 低、中、高剂量组分别以25、50、100 mg/kg 灌胃[8]、Anisomycin组在CRO 100 mg/kg 基础上加Anisomycin 2 mg/kg灌胃[9]，对照组和模型组灌胃相同剂量生理盐水，每天1 次，连续给药1 周。除对照组外，其余小鼠最后1 次药物干预1 h 后，参照文献[10]采用腹腔注射LPS（5 mg/kg）构建肺炎模型，对照组注射相同剂量生理盐水。24 h 后小鼠出现呼吸频率增快、精神萎靡、活动减少等症状表明模型构建成功，对造模不成功或出现死亡的各组小鼠共10 只及时补充。

1.3.2 样本采集 各组小鼠造模72 h 后，眼球取血，离心取上清液-80 ℃保存；麻醉处死小鼠，取5 只小鼠手术暴露气管并插管，用磷酸缓冲盐溶液冲洗3 次，获得肺泡灌洗液（BALF），离心取上清液-80 ℃保存；剩余5 只小鼠分离肺组织，取小鼠左肺测量湿/干（W/D）比，右肺上叶进行HE 染色，其余肺组织-80 ℃保存进行蛋白免疫印迹（Western Blot）检测。

1.3.3 肺W/D 比 取小鼠左肺，擦净肺组织表面液体后称质量以获得湿质量，后将肺组织置于80 ℃的烘箱中 48 h 至质量稳定，再次称取获得干质量，W/D比由湿质量与干质量之比计算。

1.3.4 HE 染色观察肺部组织病理变化及病理损伤评分 取小鼠右上叶肺生理盐水洗净，4%多聚甲醛固定、石蜡包埋，制备肺切片（4 μm），脱蜡后HE染色，脱水封片在电子显微镜下观察肺部组织病理学变化并拍照。并进行肺组织病理损伤评分，根据以下参数进行评分：1）有无出血。2）水肿程度。3）肺泡充血，中性粒细胞在空隙空间或血管壁聚集。4）肺泡壁厚度/透明膜形成。分别记为0～4 分，分数越高损伤程度越重。

1.3.5 MPO 活性检测 取-80 ℃肺组织并准确称质量，并将组织在反应缓冲液中均质化（质量/体积比=1∶19），然后按照MPO 试剂盒说明检测肺组织的MPO 活性，测定450 nm 处吸光度变化。

1.3.6 BALF 中细胞计数 取-80 ℃保存的BALF，采用血细胞计数器和吉姆萨染色进行计数总细胞、中性粒细胞和白细胞。

1.3.7 血清和BALF 中炎症因子 取-80 ℃保存的血清和BALF，按照ELISA 试剂盒说明书，检测炎性因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 的水平。

1.3.8 血清和BALF 中 MDA、SOD 水平 取-80 ℃保存的血清和BALF，按照试剂盒说明书，检测炎性因子MDA、SOD 的水平。

1.3.9 Western Blot 检测蛋白表达 取-80 ℃保存幼年小鼠肺组织，用RIPA 裂解，提取总蛋白，用BCA试剂盒进行浓度定量，按步骤将蛋白SDS-PAGE 电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，在4 ℃下加入一抗p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）过夜孵育，清洗，在4 ℃下加入二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000），孵育2 h。用ECL 发光显影，观察拍照，各条带灰度值用Image J 软件处理分析。

1.4 统计学处理 数据采用SPSS 22．0 软件进行统计分析，计量资料统计描述用均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q 检验，P＜0．05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠W/D 比和MPO 活性变化 与对照组比较，模型组小鼠肺W/D 比、MPO 活性显著升高（P＜0．05）；与模型组比较，DEX 组和CRO 低、中、高剂量组肺W/D 比、MPO 活性显著下降（P＜0．05），DEX 组与CRO 高剂量组间差异无统计学意义（P＞0．05）；与CRO 高剂量组比较，Anisomycin 组肺W/D比、MPO 活性显著升高（P＜0．05）。见表1。

表1 各组小鼠肺W/D 比和MPO 活性比较（±s）Tab.1 Comparison of lung W/D ratio and MPO activity in each group（±s）

表1 各组小鼠肺W/D 比和MPO 活性比较（±s）Tab.1 Comparison of lung W/D ratio and MPO activity in each group（±s）

注：与对照组比较，*P＜0．05；与模型组比较，#P＜0．05；与CRO 高剂量组比较，△P＜0．05。

?组别动物数肺W/D 比MPO（U/g）对照组52．58±0．261．28±0．15模型组55．71±0．82*5．82±0．91*DEX 组52．65±0．31#1．42±0．20#CRO 低剂量组54．26±0．57#4．31±0．36#CRO 中剂量组53．14±0．46#3．06±0．42#CRO 高剂量组52．68±0．35#1．40±0．21#Anisomycin 组55．02±0．71△5．68±0．73△

2.2 各组小鼠肺组织病理学变化及病理损伤评分 对照组小鼠肺结构完整，无炎症、水肿、出血，未见炎性细胞浸润；模型组小鼠出现肺组织损伤，肺泡壁有增厚融合，水肿破裂的肺泡充满红血球，肺间质有炎性细胞浸润，病理损伤评分显著升高（P＜0．05）；DEX 组和CRO 低、中、高剂量组小鼠肺组织病理损伤减轻，少量炎性细胞浸润，DEX 组与CRO 高剂量组改善效果相似，病理损伤评分显著下降（P＜0．05）；Anisomycin 组相比于CRO 高剂量组，肺部病理损伤加重，病理损伤评分显著升高（P＜0．05）。见图1 和表2。

图1 各组幼年小鼠肺组织HE 染色图（×200）Fig.1 HE staining of lung tissue in young mice of each group(×200)

表2 各组小鼠肺组织损伤病理评分（±s）Tab.2 Pathological score of lung tissue injury in mice of each group（±s）

表2 各组小鼠肺组织损伤病理评分（±s）Tab.2 Pathological score of lung tissue injury in mice of each group（±s）

注：与对照组比较，*P＜0．05；与模型组比较，#P＜0．05；与CRO 高剂量组比较，△P＜0．05。

?

2.3 各组小鼠BALF 中细胞计数 与对照组比较，模型组小鼠总细胞、中性粒细胞和白细胞计数显著升高（P＜0．05）；与模型组比较，DEX 组和CRO 低、中、高剂量组总细胞、中性粒细胞和白细胞计数显著下降（P＜0．05），DEX 组与CRO 高剂量组间差异无统计学意义（P＞0．05）；与CRO 高剂量组比较，Anisomycin 组总细胞、中性粒细胞和白细胞计数显著升高（P＜0．05）。见表3。

表3 各组小鼠BALF 中细胞计数（±s）Tab.3 Cell count in BALF of mice in each group（±s）

表3 各组小鼠BALF 中细胞计数（±s）Tab.3 Cell count in BALF of mice in each group（±s）

注：与对照组比较，*P＜0．05；与模型组比较，#P＜0．05；与CRO 高剂量组比较，△P＜0．05。

中性粒细胞（105/mL）对照组51．09±0．100．31±0．060．81±0．10模型组52．87±0．38* 1．04±0．11*1．69±0．21*DEX 组51．35±0．18#0．53±0．09#0．94±0．09#CRO 低剂量组51．91±0．22#0．86±0．10#1．14±0．13#CRO 中剂量组51．64±0．19#0．62±0．08#1．03±0．12#CRO 高剂量组51．26±0．15#0．51±0．07#0．89±0．08#Anisomycin 组52．36±0．27△ 0．91±0．10△ 1．34±0．15△组别动物数总细胞（105/mL）白细胞（105/mL）

2.4 各组小鼠血清和BALF 中炎症因子比较 与对照组比较，模型组小鼠血清和BALF 中 IL-6、IL-1β和TNF-α 水平显著升高（P＜0．05）；与模型组比较，DEX 组和CRO 低、中、高剂量组血清和BALF 中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平显著下降（P＜0．05），DEX组与CRO 高剂量组间差异无统计学意义（P＞0．05）；与CRO 高剂量组比较，Anisomycin 组血清和BALF中 IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平显著升高 （P＜0．05）。见表4。

表4 各组小鼠血清和BALF 中炎症因子比较（±s）Tab.4 Comparison of inflammatory factors in serum and BALF of mice in each group（±s） pg/mL

表4 各组小鼠血清和BALF 中炎症因子比较（±s）Tab.4 Comparison of inflammatory factors in serum and BALF of mice in each group（±s） pg/mL

注：与对照组比较，*P＜0．05；与模型组比较，#P＜0．05；与CRO 高剂量组比较，△P＜0．05。

组别动物数血清BALF IL-6IL-1βTNF-αIL-6IL-1βTNF-α对照组519．42± 2．5119．73±2．4139．65±4．2721．25± 2．1423．18±3．0445．62± 5．09模型组581．57±10．16*63．82±7．35*87．30±9．31*98．41±10．61*78．36±8．53*117．39±12．03*DEX 组534．91± 3．17#26．19±3．62#43．17±4．57#43．28± 5．24#33．18±6．84#51．37± 5．46#CRO 低剂量组554．02± 6．83#42．58±5．23#63．57±6．39#74．38± 8．36#63．52±7．25#75．96± 8．03#CRO 中剂量组543．16± 5．60#38．06±4．75#55．28±5．42#51．52± 6．71#45．87±6．38#68．14± 7．52#CRO 高剂量组535．19± 3．81#27．05±3．16#42．05±5．14#40．81± 4．74#32．06±7．15#52．13± 5．24#Anisomycin 组565．10± 7．02△45．26±5．82△71．24±8．08△82．07±10．51△66．25±7．32△96．27±10．26△

2.5 各组小鼠血清和BALF 中 MDA、SOD 水平比较 与对照组比较，模型组小鼠血清和BALF 中 MDA水平显著升高，SOD 水平显著下降（P＜0．05）；与模型组比较，DEX 组和CRO 低、中、高剂量组血清和BALF中 MDA 水平显著下降，SOD 水平显著升高（P＜0．05），DEX 组与CRO 高剂量组间差异无统计学意义（P＞0．05）；与CRO 高剂量组比较，Anisomycin 组血清和BALF 中 MDA 水平显著升高，SOD 水平显著下降（P＜0．05）。见表5。

表5 各组小鼠血清和BALF 中MDA、SOD 比较（±s）Tab.5 Comparison of MDA and SOD in serum and BALF of mice in each group（±s）

表5 各组小鼠血清和BALF 中MDA、SOD 比较（±s）Tab.5 Comparison of MDA and SOD in serum and BALF of mice in each group（±s）

注：与对照组比较，*P＜0．05；与模型组比较，#P＜0．05；与CRO 高剂量组比较，△P＜0．05。

SOD（U/mL）对照组513．52±2．47 53．29±6．01 18．43±2．71 59．23±5．31模型组561．38±6．84* 21．57±3．64* 63．18±6．49* 23．47±3．15*DEX 组526．38±3．71# 48．36±6．29# 25．17±3．08# 50．39±6．14#CRO 低剂量组549．06±4．91# 30．52±4．37# 46．39±5．17# 38．47±4．61#CRO 中剂量组538．25±3．92# 41．08±6．03# 36．59±4．27# 45．36±5．71#CRO 高剂量组527．58±3．06# 49．53±6．38# 24．68±3．25# 51．08±6．35#Anisomycin 组551．86±6．93△25．72±3．14△50．63±6．84△25．72±3．14△组别动物数血清BALF MDA（nmol/mL）SOD（U/mL）MDA（nmol/mL）

2.6 各组小鼠MAPK/NF-κB 通路蛋白表达比较 与对照组比较，模型组小鼠p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα 显著升高（P＜0．05）；与模型组比较，DEX 组和CRO 低、中、高剂量组p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NFκB p65、p-IκBα/IκBα 显著下降（P＜0．05），DEX 组与CRO 高剂量组间差异无统计学意义（P＞0．05）；与CRO高剂量组比较，Anisomycin 组p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα 显著升高（P＜0．05）。见图2 和表6。

图2 各组小鼠肺组织蛋白表达结果Fig.2 Protein expression in lung tissue of mice in each group

表6 各组小鼠MAPK/NF-κB 通路蛋白表达比较（±s）Tab.6 Comparison of MAPK/NF-κB pathway protein expression of mice in each group（±s）

表6 各组小鼠MAPK/NF-κB 通路蛋白表达比较（±s）Tab.6 Comparison of MAPK/NF-κB pathway protein expression of mice in each group（±s）

注：与对照组比较，*P＜0．05；与模型组比较，#P＜0．05；与CRO 高剂量组比较，△P＜0．05。

p-IκBα/IκBα对照组50．45±0．070．53±0．080．48±0．05模型组50．96±0．12*0．98±0．09*0．94±0．10*DEX 组50．49±0．07#0．62±0．06#0．55±0．06#CRO 低剂量组50．73±0．08#0．80±0．08#0．82±0．09#CRO 中剂量组50．65±0．07#0．68±0．08#0．70±0．08#CRO 高剂量组50．47±0．05#0．58±0．06#0．53±0．06#Anisomycin 组50．78±0．08△0．90±0．09△ 0．85±0．09△组别动物数p-p38 MAPK/p38 MAPK p-NF-κB p65/NF-κB p65

3 讨论

由于儿童的气道纤毛和免疫系统尚未发育完全，呼吸道经常暴露在碳颗粒、病毒和其他刺激物中，很容易引起肺炎等呼吸道疾病，严重影响患儿的生长发育，造成沉重的经济和社会负担[2]。LPS 与许多肺部炎症性疾病的发展有关，可刺激呼吸系统的免疫功能，引起急、慢性炎症反应，导致肺损伤、肺气肿、气道重塑等病理改变，影响儿童肺发育[11]。以往的研究主要是针对中老年呼吸系统疾病，而关于儿科呼吸系统疾病研究相对较少。本研究通过LPS 法构建幼年小鼠肺炎模型，选用3～4 周龄小鼠，其免疫功能和组织修复功能弱，肺部发育与人类的童年早期相似，为探究儿童肺炎的机制及临床应用奠定基础。本研究结果显示，模型组小鼠出现肺组织损伤，肺泡水肿出血，大量炎性细胞浸润，肺W/D比和病理损伤评分显著升高，表明肺炎小鼠模型构建成功。模型组小鼠BALF 中总细胞、中性粒细胞和白细胞计数显著升高，且血清和BALF 中 TNF-α、IL-lβ、IL-6、MDA 水平显著升高，SOD 水平显著降低，表明LPS 诱导炎症因子和氧化应激反应，多种炎症因子又通过激活中性粒细胞和巨噬细胞活化，进一步导致肺部炎症发生。

CRO 已被证实能通过发挥抗氧化、抗炎等作用对肺部炎症损伤起到保护作用，不仅可通过抑制炎症信号通路来缓解LPS 诱导的急性呼吸窘迫综合征和肺损伤[12]；还通过发挥对白细胞和淋巴细胞的免疫调节作用，降低卵清蛋白致敏小鼠肺部炎症[8]。本研究发现，CRO 干预后小鼠肺组织病理损伤减轻，少量炎性细胞浸润，肺W/D 比和病理损伤评分、BALF 中总细胞、中性粒细胞和白细胞计数以及血清和BALF 中炎症因子和MDA 水平显著降低，SOD水平显著升高，表明CRO 具有减轻小鼠肺炎的功效，主要是通过发挥抗炎、抗氧化、免疫调节作用。本研究还选用DEX 作为阳性药物，其对小鼠肺炎损伤的改善效果与CRO 高剂量组效果相似，说明CRO对LPS 诱导的肺炎具有很好的改善效果。

MAPK 作为介导基本生物学过程和细胞对外部应激的信号分子，可被各种炎症和应激刺激激活来调节免疫应答，p38 MAPK 通路作为MAPK 信号传导的纽带，与炎症密切相关，在TNF-α、IL-1β 和IL-6的产生中起重要作用[13]。且MAPK 是NF-κB的上游激活剂，p38 MAPK 在NF-κB 向细胞核的活化和迁移中起重要作用，可通过激活NF-κB 促进促炎介质的表达。正常情况下，NF-κB 以非活性状态与IκB结合的状态存在于细胞质中，LPS 刺激增加MAPK的磷酸化，导致NF-κB 活化并以p65 活性形式易位到细胞核中，增加促炎细胞因子表达和过度炎症反应的发生[14]。Wang 等[15]研究发现抑制p38 MAPK 可缓解肺缺血再灌注损伤，可能是治疗急性肺损伤的有效方法。Yu 等[16]也发现使用NF-κB 抑制剂可改善炎症，进而预防LPS 诱导的急性肾损伤和肺损伤。还有研究表明，抑制MAPK/NF-κB 信号通路可以减少肺部炎症和血管重塑，并减轻 LPS 诱导的急性肺损伤[17]。本研究发现，模型组小鼠p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα表达显著升高，表明LPS 刺激可能激活MAPK/NFκB 信号通路。而CRO 干预后p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα 表达降低，表明CRO 可能具有抑制MAPK/NF-κB 激活的作用。这与CRO 通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路发挥对脓毒症诱导的肝、肾和肺损伤的保护作用，以及抑制NF-κB 信号传导来减轻心肌纤维化中的氧化应激、炎症和细胞凋亡[6，18]结果相似，为进一步验证CRO 对MAPK/NF-κB 信号通路的干预作用，本研究在CRO 高 剂量组的基础上加上MAPK 激活剂Anisomycin，CRO 对LPS 诱导的肺炎小鼠的改善作用受到抑制，因此猜测CRO 的作用机制可能与抑制MAPK/NF-κB 信号通路的激活有关。

综上，CRO 可能通过抑制MAPK/NF-κB 通路激活，减少炎症反应和氧化应激，对LPS 诱导的肺炎小鼠肺部损伤有治疗作用。本研究为改善幼年肺炎小鼠提供了新思路，但仅初步探讨CRO 对幼年肺炎小鼠的治疗作用，后续将进一步探讨CRO 对成年小鼠的治疗作用以及研究药物与年龄的相关性。