冷链食品中诺如病毒的检测方法研究以及污染状况分析*

柯振华

[福建省产品质量检验研究院 国家加工食品质量监督检验中心（福州），福建 福州 350002]

0 引言

冷链食品是指需要在整个供应链过程中保持低温环境的食品，这种供应链包括从生产、加工、运输到销售的各个环节。冷链食品通常包括生鲜食品（如肉类、海鲜、蔬菜、水果等）和冷冻食品（如冷冻肉类、冷冻水饺等）[1,2]。为了保持食品的低温状态，冷链食品通常需要使用专门的冷藏设备、保鲜包装和运输工具，这样可以延长食品的保质期，减少食品损耗，并确保消费者能够购买到新鲜和安全的食品[3]。

食源性病毒是指通过食物传播的病毒感染，这些病毒通常通过被病毒污染的食物或饮水进入人体，引发消化系统的疾病，常见的食源性病毒包括诺如病毒、轮状病毒、肠炎病毒、腺病毒等[4-7]。食源性病毒可以通过多种途径传播，如不洁食物处理、食品交叉污染、生食食品、未充分烹饪的食物等。一旦食物被病毒污染，食用后就有可能感染病毒。食源性病毒感染的症状通常包括腹泻、呕吐、发热、腹痛等消化系统问题，症状通常在感染后几个小时到几天内出现，持续时间也会有所不同[8-11]。

目前，常用的食品中诺如病毒的检测方法包括：

⑴ PCR检测。利用聚合酶链反应（PCR）技术，通过检测食品中诺如病毒的核酸，快速准确地确定食品是否受到病毒污染。这种方法需要特定的实验室设备和专业人员进行操作，通常用于食品安全监测机构或实验室进行检测。

⑵ ELISA检测。酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种常用的食品中病毒检测方法，通过检测食品中诺如病毒的蛋白质，可以快速准确地确定食品是否受到病毒污染。这种方法相对简单，可以在一般实验室条件下进行。

⑶ 快速检测试纸。市场上也有一些便携式的快速检测试纸，可以用于快速检测食品中的诺如病毒。这种方法操作简单，但准确性可能相对较低，通常用于初步筛查或在没有实验室设备的场合。

诺如病毒（Norovirus）是一类常见的RNA病毒，属于科尔沁病毒科（Caliciviridae）下的诺如病毒属（Norovirus genus），是引起全球急性胃肠炎的主要致病源，全年均可感染，主要感染儿童、老人和免疫力低下人群[12,13]。诺如病毒主要通过食物和水传播，特别是生鲜食品、冷冻食品和海鲜等容易受到病毒污染的食品，又被称作食源性病毒和水源性病毒。食源性病毒和水源性病毒主要通过粪-口途径传播，因其传染性强和传播速度快等特征，成为严重威胁人民群众的健康和生命安全的重大因素。在食源性病毒和水源性病毒引起的食品安全事故或突发公共卫生事件中，诺如病毒占据了重要地位[14,15]。

由于食品品种和水源的种类繁多，成分复杂，污染的病毒含量低，病毒分布不均一，且含有各种抑制病毒检测的因子等因素，使得食源性病毒和水源性病毒检测成为全球公共卫生面临的重点和难点。我国已建立了全国病毒性腹泻监测网络，具备了完整的引起腹泻病毒病相关病毒的检测技术体系[16-18]。但我国建立食源性病毒和水源性病毒检测体系起步晚，体系还不完善。目前，我国仅发布了食品（贝类，生食蔬菜，胡萝卜、瓜、坚果等硬质表面食品，草莓、番茄、葡萄等软质水果等食品）中诺如病毒检测的食品安全国家标准GB 4789.42—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验》，但是该标准不包括冷链食品中诺如病毒检测方法。

目前大部分食源性病毒的暴发均与冷链食品，如冷冻水产品和冷藏食品等有关，为了能检测到冷链食品中低浓度和分布不均的病毒粒子，需要建立更加适宜的方法来开展冷链食品现场采样和提高冷链食品中病毒检测的灵敏度。

本研究旨在开发冷链食品中诺如病毒核酸检测方法并进行实验室评价和应用，通过建立冷链食品中诺如病毒检测方法并形成操作规范，为我国冷链食品中如诺如病毒的检测、监测和应对提供可借鉴的标准化实验室检测技术。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验设备

荧光PCR检测系统（ABI 7500）；恒温摇床；高速冷冻低温离心机；均质器；小型离心机；制冰机；电子天平；生物安全柜；高压灭菌锅；-20 ℃低温冰箱；-80 ℃超低温冷冻冰箱；纯水仪；制冰机等

1.1.2 实验试剂

无水乙醇；氯化钠；三氯甲烷；聚乙二醇PEG8000；正丁醇；蛋白酶K；DEPC水；磷酸盐缓冲液；Tris等。

病毒RNA提取试剂盒（QIAGEN）；逆转录-PCR试剂盒。

诺如病毒阳性质控样品购自中国食品药品鉴定研究院。

1.2 实验方法

1.2.1 冷链食品样本收集

本研究从市场中采集了冷链水产品如贝类、冷冻带鱼等，共采集冷链食品共383份。所有样品采购后送至实验室，立即进行样本处理。

1.2.2 贝类样本处理

生物安全柜紫外消毒30 min，准备无菌的手术刀片，离心管、培养皿和冰盒等。对于冷链食品如贝类等去壳，在培养皿上收集消化腺和肠道组织，并将其置于50 mL离心管中，向组织中加入诺如病毒阳性对照以及过程对照病毒，再将离心管置于冰盒内，用均质器将样本研磨打碎成糊状。将均质后的样品称取3.0 g转移至15 mL离心管中，加入PBS磷酸盐缓冲液3 mL，混匀，加30μL的20 mg/mL蛋白酶K消化蛋白质，使用恒温摇床在37 ℃、300 r/min转速下，孵育消化45 min。将离心管65 ℃水浴10 min后，3500 r/min转速下离心10 min，将上清液转移到新离心管中。

1.2.3 冷链食品中病毒的分离

取1 mL经前处理后的贝类样本分别经过0.45 μm和0.22 μm孔径的滤器过滤，以除去细菌等非病毒物，采用DNA酶消化无病毒衣壳保护的游离的基因组以降低宿主基因组的干扰。酶解处理后参照Qiagen RNA提取试剂盒说明书提取病毒核酸。

1.2.4 引物与探针的设计与合成

本研究依据常见的诺如病毒GⅠ型和GⅡ型目标基因序列设计特异性引物和探针，具体引物探针信息见表1。

表1 引物和探针序列

1.2.5 实时荧光PCR反应体系与反应参数

PCR反应体系：总体积30 μL，预混液15 μL，上游与下游引物各2 μL，荧光探针1.0 μL，模板DNA 5.0 μL，无菌水补足PCR反应体系体积至30 μL。

使用实时荧光PCR仪器对诺如病毒样本进行扩增，具体反应条件：60 ℃逆转录3 min；95 ℃预变性30 s，95 ℃变性 15 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，进行45个循环。

2 结果与分析

2.1 诺如病毒荧光PCR扩增结果（图1）

图1 诺如病毒荧光PCR扩增结果图

2.2 冷链食品中诺如病毒的检测情况

为了验证本研究所建立研究方法的适用性与可靠性，掌握冷链食品中诺如病毒污染情况，本研究共从市场中随机抽取了383份冷链食品样品开展检验工作，其中有27份样本检出诺如病毒，总体检出率为7.0%，具体检验数据见表2。

表2 不同类别冷链食品中诺如病毒检测情况

通过分析比较可以看出，冷鲜水产品如牡蛎以及贻贝等诺如病毒检出率较高，这可能与这些水产贝类腮腺和生殖腺可以富集诺如病毒有关。

2.3 诺如病毒分型结果

本研究从冷链食品中检测到的27株诺如病毒，其中有25份为诺如病毒GⅡ型，2份为诺如病毒GⅠ型。

3 讨论

本研究共从市场中抽取383份冷链食品样品，主要涉及冷鲜蔬菜，冷鲜水果，冷鲜水产品，速冻水产制品，速冻肉制品等类别，共有27份阳性样品，总检出率为7.0%。

目前国内外文献报道，对于诺如病毒感染者排泄物中诺如病毒检测主要采取荧光定量PCR方法[19,20]，但对于食品中诺如病毒的检测报道不多。由于冷链食品基质比较复杂，干扰因素很多，目前对于冷链食品中诺如病毒的检测报道较少。同时，我们在样品加标试验过程中发现，诺如病毒在冷链食品中回收率较低，有可能会导致假阴性结果。本实验在试验过程中添加诺如病毒阳性质控球作为质量控制的有效手段，通过反复优化样本前处理方法，优化蛋白酶K的浓度与添加量，添加阴性对照病毒质控球作为阴性对照，添加空白对照等控制假阳性或者假阴性结果，充分保证检验方法准确可靠。

在本研究抽样检测的冷链食品中，牡蛎、贻贝等冷鲜水产品，草莓等冷鲜水果，速冻扇贝等速冻水产制品中均检测出诺如病毒。冷鲜水产品中检出率较高，达到12.5%，冷鲜水果中检出率为6.0%，速冻水产制品的检出率为2.5%，总体检出率为7.0%，该检出率水平与国内相关研究报道相吻合。

本次诺如病毒检测针对的主要是冷链食品，发现检出阳性的样品主要是以水产品，如贝类等为主，检出的诺如病毒以GⅡ型为主。贝类食品是造成诺如病毒感染的高风险食品，这和贝类对于近海水域诺如病毒的富集等有关。对于公众消费者而言，我们应该尽量选择洁净水域生产的水产品，同时需要将水产品彻底加工煮熟后再食用，同时还需要将生熟食品分区存放，避免交叉污染，保障食品安全。

本研究优化了冷链食品中诺如病毒的富集方法，通过阳性质控以及阴性质控毒株加标的方法建立了冷链食品中诺如病毒的检测方法，分析统计了不同类别冷链食品中诺如病毒的检出率和检测情况，方法可广泛应用于冷链食品中诺如病毒等相关病原体的快速筛查检测与溯源分析。