高效液相色谱检测法同时测定贝类产品中的金霉素和多西环素*

王明辉，郑丽婷，李书宜，张育眉，徐晖*

（1.平潭综合实验区质量计量检测中心，福建 福州 350400；2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002）

我国是贝类生产大国和养殖大国，贝类产品养殖已经成为沿海海水养殖业的支柱之一。近年来，国内市场对贝类食用的安全性愈加关注，消费习惯的改变和生食观念的增加导致有关食品安全问题的舆论发酵[1]，食品安全问题为大家所关注，消费者对于贝类产品的食用安全性提出了更高的要求。

为了预防和治疗动物疾病，以及提高动物的生产产量和性能，畜牧养殖业中的养殖户通常会在饲料中添加四环素类或其他类型的抗生素[2]。四环素类抗生素（TCs）属于广谱抗生素，常见的有金霉素（chlortetracycline）、土霉素（oxytetracycline）和多西环素（doxycycline）等，在治疗布鲁氏菌病、皮肤痤疮、急性呼吸道感染等疾病中有广泛临床应用[3,4]。TCs由于其较稳定的结构，在环境中往往难以降解。畜禽的粪便中含有大量TCs[5]，经过各种途径污染环境、植物以及水体，使水体中长期残留TCs。水中一些藻类会受到TCs残留的污染，并在体内积蓄，贝类动物以这些藻类为食，进而导致在贝类体内富集。许多TCs对身体某些器官的细胞有毒性，并使人体内的多种新陈代谢作用放缓。食品中残留的TCs可能在一些过敏个体中引起过敏反应或毒性反应[6]，还有可能引致血液疾病或中枢神经系统的不良反应[7]。

目前，TCs药物残留的仪器检测方法有多种，包括高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱仪-串联质谱法（HPLC-MS）、薄层色谱法（TLC）和毛细管电泳法（CE）。这些方法在准确性和精密度方面具有显著优势。

Desmarchelier等人[8]开发了一种液-液萃取方法，该方法结合LC-MS/MS来检测食品中的多种抗生素及其异构体。使用EDTA和乙腈进行液-液萃取。由于低温相分离情况较好，随后进行冷冻步骤，最终使用正己烷脱脂的样品萃取物进行LC-MS/MS法检测。

Shalaby等人[9]开发了一种利用高效液相色谱二极管阵列检测方法（HPLC-DAD），该方法使用C18-E柱进行净化，结果表明肉和肝的回收率分别为71.88%～92.44%和68.88%～84.84%，可以用于检测鸡肉和肝脏中四环素残留量。

微生物检测技术可以用于检测四环素类抗生素（TCs）的残留。该方法基于微生物菌落生长状态受TCs药物影响这一原理，通过测定TCs浓度与抑制圈大小之间的正比关系来检测TCs残留。这种方法操作简便、费用低廉且可实现对大量样品进行同时检测，缺点是可能受到其他抗生素的干扰，且培养微生物耗时较长，专一性和准确性有提升的空间。

针对TCs残留问题，陈树桥等人[10]建立了一种以藤黄微球菌为检测菌的微生物检测方法，该方法可用于青虾肌肉组织中的土霉素残留检测。该方法的标准曲线线性范围为0.325～12 μg/mL，最低检测限为2.0 μg/g，其检测结果能够与高效液相色谱法得出的结果呈现良好的线性相关性。但面临样品制备复杂、成本高、操作繁琐等问题，不适合现场快速检测等应用需求。

Wambeke等人[11]利用HPLC方法对鸡蛋和肉鸡中残留的土霉素进行检测，检测限分别为2.2～13.0 ng/mL和10.5～20.9 ng/mL。

四环素残留在环境中很难被完全降解，贝类的特殊滤食性进食方式容易将环境中的污染物积蓄到体内，这最终会通过食物链威胁到人类的健康，因此需对四环素在贝类中的残留进行监测。本实验通过对提取、净化等前处理条件及检测波长等进行优化获取最佳检测条件，通过绘制标准曲线、计算定量限等进行方法验证，建立了一种同时测定贝类产品中金霉素、多西环素残留的SPE结合HPLC 方法，并应用于实际贝类样品的检测。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

金霉素、多西环素标准品（均来自BePure）；实验室用水为Milli-Q超纯水；甲醇（色谱纯，来自GRACE公司）；乙腈（色谱纯，来自默克公司）。

1.2 主要仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪+紫外检测器（美国Waters公司）；氮吹仪（型号：MG-2200，上海虔钧科学仪器有限公司）；均质机（型号：T25 digital ULTRA-TURRAX，德国IKA公司）；高速冷冻离心机（型号：GL-21M，长沙湘智离心机仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制

标准储备液的制备：用甲醇溶液与金霉素、多西环素标准品制备浓度为50 μg/mL的金霉素、多西环素标准储备液，于-20 ℃保存。

标准曲线溶液的配制：用甲醇溶液配制成金霉素、多西环素含量浓度为0.20、0.50、1.0、2.0、5.0 μg/mL的混合标准溶液。

1.3.2 色谱条件

色谱柱（Inertsil ODS-3 C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相：甲醇∶乙腈∶草酸溶液（0.02 mol/L）=10∶20∶70（体积比）。流速1.0 mL/min，进样量20 μL，柱温25 ℃。检测波长355 nm。检测时间16 min。

1.3.3 样品前处理

⑴ 样品的制备：鲍鱼、牡蛎在未完全解冻状态下进行处理，收集除壳以外的全部软组织和体液，在常温下捣碎或剪碎，均质后备用。

⑵ 样品的提取：称取样品(2.0±0.02)g放入50 mL聚乙烯离心管中，加入70%甲醇溶液16 mL，再加入Na2EDTA-McClvine缓冲溶液4 mL，涡旋混合2 min，在冰水浴中超声处理10 min后，在4 ℃下以8000 r/min离心10 min。收集上清液，向剩余残留物中加入70%甲醇溶液8 mL，再加入 Na2EDTAMcClvine缓冲溶液2 mL。重复上述操作，收集上清液并汇合在一起。

⑶ 样品的净化：依次在HLB柱中加入5 mL甲醇、5 mL超纯水、70%甲醇溶液3 mL。活化HLB柱后将上述的样品提取溶液上样，加入5%甲醇水溶液10 mL和10 mL水进行淋洗。抽干水后，用6.0 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，并在40 ℃氮吹下浓缩至干，用1.0 mL甲醇溶液再次溶解。使用涡旋机将溶液在涡流中混合，通过0.22 μm过滤膜后测量。

2 结果与分析

2.1 样品提取液的优化

由于四环素易与金属离子络合形成螯合物且在酸性条件下较为稳定[12]，本试验在提取样品时加入了pH值为4的Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，以降低螯合作用提高回收率。在此基础上，本试验对比了70%乙腈（ACN）溶液、70%丙酮（AC）溶液、70%甲醇（MeOH）溶液、0.1%甲酸-乙腈（FA-ACN）溶液4种不同提取溶剂在牡蛎、鲍鱼基质中对金霉素、多西环素回收率的影响，结果如图1、图2所示。试验结果显示，在牡蛎基质中，与其他3种溶剂相比，70%甲醇（MeOH）溶液回收率最高，在鲍鱼基质中亦是如此。因此，本试验最终选择Na 2E DTAMcllvaine+70%甲醇（MeOH）溶液作为样品中金霉素、多西环素的萃取溶剂。

图1 牡蛎基质中不同提取溶剂对CTC、DTC回收率的影响

图2 鲍鱼基质中不同提取溶剂对CTC、DTC回收率的影响

2.2 固相萃取柱的优化

海水贝类样品基质复杂，自身携带盐及较高的Cu2+会影响检测效果，因此需要对样品进行净化处理[13]。本试验对比了C18柱和HLB柱作为固相萃取净化柱对鲍鱼、牡蛎基质中金霉素、多西环素回收率的影响。从图3和图4可知，使用C18柱时，在牡蛎基质中CTC、DTC的回收率分别为73.97%、73.01%，鲍鱼基质中CTC、DTC的回收率分别为79.55%、80.87%；使用HLB柱时，在牡蛎基质和鲍鱼基质中CTC、DTC的回收率分别为107.35%、95.74%及108.66%、103.82%。结果表明，使用HLB柱的回收率明显优于C18柱的回收率，因此，本试验选择HLB萃取柱对贝类样品进行净化。

图3 牡蛎基质中不同萃取柱对CTC、DTC回收率的影响

图4 鲍鱼基质中不同萃取柱对CTC、DTC回收率的影响

2.3 检测条件的选择

本试验选择ODS-3 C18柱对金霉素（CTC）、多西环素（OTC）进行分离，以乙腈、甲醇（比例为2∶1）作为有机相，0.02 mol/L草酸水溶液作为水相流动相，避免金属离子对四环素的螯合作用，从而获得更好的峰型，用高效液相色谱仪配合紫外检测器（分别使用350 nm、355 nm波长）对进行金霉素、多西环素标准溶液进行检测，对比了不同波长下CTC、DTC的检测效果。结果显示，在355 nm处，杂峰较少峰形良好且灵敏度更高，CTC、DTC的洗脱效果、分离效果较好（见图5）。因此，本试验选择了甲醇∶乙腈∶0.02 mol/L草酸溶液（10∶20∶70，体积比）为流动相，355 nm为检测波长作为检测条件。

图5 高效液相色谱法同时检测金霉素和多西环素的色谱图

2.4 标准曲线及线性关系

采用高效液相色谱法测定标准曲线溶液，将峰面积（y）与金霉素、多西环素的质量浓度（x）进行线性拟合，得到回归方程及相关系数。从图6和图7可以看出，金霉素和多西环素在200～5000 ng/mL的范围内呈线性关系，且相关性良好，相关系数（R2）均大于0.99，可用于贝类产品中四环素类抗生素的定量分析。

图6 金霉素的标准曲线

图7 多西环素的标准曲线

2.5 检出限

按信噪比S/N=3计算检出限，如表1所示，检测方法对金霉素、多西环素的检出限分别为54.55、14.29 μg/kg，可满足水产贝类中CTC、DTC残留的检测要求。

表1 所测样品中金霉素和多西环素的残留量

2.6 实际样品的测定与分析

采用以上建立的方法对样品进行测定和分析，结果见表2。BG1、BG2、BG3是鲍鱼实际样品，ML1、ML2、MA是牡蛎实际样品。根据GB 31650—2019，我国对四环素类抗生素的最大残留量规定肌肉中最大残留限量为100 μg/kg，在肝脏、肾脏等组织中稍高，为300 μg/kg和600μg/kg。检测结果表明，在牡蛎样品中2种四环素均未检出，在鲍鱼样品中CTC、DTC均有检出但未超过国家规定的最大残留限量。

表2 样品中金霉素和多西环素的残留量

3 结论

本试验通过优化样品液提取条件、净化条件、色谱检测条件，建立了一种固相萃取结合高效液相色谱检测方法，可同时检测贝类产品中的金霉素和多西环素的残留量。采用Na2EDTA-Mcllvaine +70%甲醇（MeOH）溶液提取样品液，HLB柱作为固相萃取小柱对样品液进行净化，并以甲醇∶乙腈∶0.02 mol/L草酸溶液（10∶20∶70，体积比）为流动相，355 nm为检测波长进行检测，通过加标回收等进行方法验证，结果表明CTC、DTC在相应的浓度范围内线性关系良好，相关系数大于0.99，检测方法检出限分别为54.55 μg/kg、14.29 μg/kg，可满足水产贝类中CTC、DTC残留的检测要求。