EDTA过氧化氢修复对富含黑色素肿瘤组织染色的效果

刘 丹 刘盛均 陈 杨 柯 琦 王安群 四川省绵阳市中心医院病理科 621000

恶性黑色素瘤是病理科日常工作中比较常见的一类肿瘤,需进行免疫组化染色辅助诊断,但部分黑色素瘤中黑色素大量沉积,形成深浅不一的棕黄色、棕褐色或棕黑色的黑色素颗粒,与免疫组化染色常用的DNA显色剂颜色非常接近,相互干扰,难以区分,影响判读。这就需要用一些方法来去除这些干扰,传统的脱色素方法是用强氧化剂高锰酸钾/草酸法去除黑色素后再进行免疫组化染色,此方法易造成组织脱片及破坏抗原,不被推荐。目前很多学者推荐免疫组织化学染色完成后,运用不同的复染液将黑色素颗粒显色为不同程度的绿色,可改善掉片现象及抗原性的丢失,但此方法不适用于含大量黑色素的组织,存在物理遮蔽影响抗原抗体结合,造成假阴性等问题。据病理诊断的需要及染色技术的可操作性,笔者探索在EDTA(pH 9.0)抗原修复液中加入过氧化氢使过氧化氢浓度为0.75%,在修复的同时去除黑色素,此方法简便快捷经济,获得满意效果,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2021年5例本院已确诊的富含黑色素的恶性黑色素瘤存档蜡块,其中鼻咽部1例、足根部2例;眼睑2例,另选取1例HE染色显示含极少黑色素的恶性黑色素瘤存档蜡块作为对照。试剂:抗原修复液(EDTA,pH 9.0)、PBS磷酸盐缓冲液、一抗HMB45、S-100、MelanA、Ki-67及免疫组化Maxvision试剂盒均购自福州迈新公司;30%过氧化氢购自成都市科隆化学品有限公司。实验分为对照组和实验组两组。对照组不做脱色素处理,实验组在EDTA(pH 9.0)抗原修复液中加入过氧化氢使过氧化氢浓度为0.75%,修复的同时去除黑色素处理。

1.2 方法 所有标本均用10%中性缓冲福尔马林固定,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡浸泡后包埋制成蜡块,选取5例黑色素瘤组织的肿瘤且富含黑色素部分与对照组织一同制成芯片组织,连续切片10张,编号1～10,厚3μm,多聚赖氨酸包被载玻片捞片,65℃烤片2h,脱蜡至水待用。对照组:取编号为1的切片常规步骤做HE染色,再取编号为2～5的切片常规Maxvision法行免疫组织化学染色,2～5号分别标记HMB45、S-100、MelanA、Ki-67。免疫组化染色具体步骤如下:pH 9.0 EDTA高温修复20min,3%H2O215min,一抗室温45min,二抗室温20min,DAB显色室温10min,流水冲洗,苏木素对比染色后脱水透明封片。实验组:取编号为6～10的切片,放入沸腾的EDTA(pH 9.0)过氧化氢溶液中高温修复20min,自然冷却,蒸馏水洗,取出编号为6的切片常规步骤做HE染色,7～10号切片常规Maxvision法行免疫组织化学染色,7～10号切片分别标记抗体HMB45、S-100、MelanA、Ki-67室温45min,二抗室温20min,DAB显色室温10min,流水冲洗,苏木素对比染色后脱水透明封片。

2 结果

2.1 HE染色 对照组未做脱色素处理组织HE染色,组织中可见大量棕黄色黑色素颗粒,影响诊断(见图1)。实验组H2O2含量为0.75%EDTA(pH 9.0)过氧化氢溶液修复后HE染色黑色素去除干净,组织结构完整色彩亮丽,对比鲜明,核染色质清晰(见图2)。

图1 未脱色素HE染色

图2 EDTA过氧化氢溶液高温修复脱色素后HE染色

2.2 IHC染色 对照组未脱色素常规Maxvision法免疫组化化学染色,内源性浓密的黑色素颗粒与二氨基联苯胺(Dia-minobenzidine,DAB)染色显示的棕黄色相互混淆,无法判读(见图3);实验组H2O2含量为0.75%EDTA(pH 9.0)过氧化氢溶液修复后Maxvision法免疫组织化学染色,黑色素去除干净,阳性着色清晰,强度尚好,定位准确(见图4)。

图3 未脱色素Hmb45免疫组织化学染色

图4 EDTA过氧化氢高温修复脱色素后Hmb45免疫组织化学染色

3 讨论

黑色素瘤是来源于黑色素细胞的一种高度恶性的肿瘤,多发生于皮肤,也可见于黏膜和内脏。免疫组织化学检测常与组织病理检查相结合用于辅助诊断和鉴别诊断,检测指标主要包括反映细胞增殖的相关指标Ki-67、cyclin D1等,以及黑色素细胞的特征性标志物如S-100蛋白、SOX-10、MelanA、HMB45等。

常规免疫组织化学通常采用DAB显色,阳性区域呈棕黄色颗粒与内源性棕黄色或棕褐色黑色素颗粒颜色近似,相互干扰,难以区分,诊断困难,容易误诊。因此需要进行脱色素处理。据文献报道,国内外学者对脱黑色素进行了多种方法的探索,大致分为五类。第一类是在常规免疫组织化学染色DAB显色后,运用不同的染液复染将黑色素颗粒显色为不同程度的绿色[1-3],可与棕褐色的阳性颗粒区分,但无论使用哪种染液复染,都存在有过量黑色素在组织和细胞中堆积时物理遮蔽严重的现象,使得组织结构和细胞的形态不清,细胞的异型性和核分裂象观察困难,并妨碍抗体与细胞中抗原结合,造成假阴性或染色减弱的现象,影响诊断,因此此方法不适合含大量黑色素组织。第二类是运用罗氏免疫组化ultra View Universal AP Red Delection Kit(AP染色液)来标记抗原,FR显色使阳性颗粒为玫红色与组织原有的棕褐色色素颗粒形成对比[4],但FR显色切片不可使用乙醇类脱水剂脱水,接触乙醇类脱水剂可使标记的红色阳性颗粒褪色,导致实验失败;也不能使用二甲苯进行透明处理,影响切片的透明度和清晰度;并且FR显色切片需使用水性封片剂封固,不利于切片的长期保存;同时也存在细胞中堆积过量黑色素时会妨碍抗体与细胞中抗原结合,造成假阴性或染色减弱的问题。第三类是在组织脱水前进行脱黑色素处理获得满意结果[5],但该方法耗时太长(36～40h),脱黑色素时间与黑色素含量成正比,脱色时间难以掌握,且对是否含有黑色素难以估计。第四类是运用不同浓度的高锰酸钾脱黑色素[6],也是目前最经典常用的方法,但组织切片经强氧化剂脱黑色素处理后进行免疫组织化学检测存在一定的问题:(1)这种传统的脱色素方法费时长(2～4h),脱色素的时间与色素含量成正比,且对是否含有色素难以估计,脱色时间难以掌握;(2)草酸漂白时间不易控制,草酸漂白时要根据色素多少,随时关注切片颜色变化,至组织不再脱色时应立即水洗终止反应,若漂白时间过短,脱色不干净,若漂白时间过长,会出现细胞核淡然不着色,组织结构不清,影响阅片;(3)需考虑抗原的敏感性和特异性存在的差异[7],切片长时间浸泡在高锰酸钾中会出现部分抗原丢失,抗原抗体结合位点失去活性的情况,从而出现弱阳性或假阴性的结果;(4)易造成组织掉片,可能是由于强氧化剂作用于切片破坏了玻片上的涂胶多聚赖氨酸阳离子基团的结构,使载玻片黏附力下降导致的,从而无法进行后续的免疫组织化学染色。第五类是用H2O2脱黑色素,H2O2对大部分抗原均适用,室温下对抗原性基本无影响。刘兴华等[8]采用DAB显色后再用10%H2O2浸染,37℃过夜,出片时间会延迟1d,且若机染时复染了苏木素,苏木素也会被H2O2氧化为无色,脱色素后需再次复染苏木素,增加了操作步骤,稍显烦琐。陈永华等[9]采用PBS(pH 7.4～7.6)、NaOH(pH 10.0)配制的1.8%H2O2溶液在70℃时经70～130min,陈琼荣等[10]采用3%H2O2加热至40℃持续90min快速升温至55℃持续25min,或3%H2O2过夜处理,取得较好效果,但仍需耗时2h左右,变换的温度也不易控制。

经阅读大量文献发现,H2O2脱黑色素优于高锰酸钾及其他黑色素染色法,但费时长的问题未得到解决。H2O2脱色素的能力与温度和处理时间密切相关,温度越高时间越长脱色素越彻底,但对组织结构的破坏和抗原性的丢失也越严重,所以运用H2O2法脱黑色素时,处理好温度时间组织结构的完整性和抗原性的关系至关重要,既要保证色素去除干净又要保证组织结构完整和抗原性不丢失。笔者考虑在H2O2脱黑色素方法的基础上,继续降低H2O2浓度提高温度验证是否能达到满意的效果,经反复试验,发现EDTA(pH 9.0)本身没有脱色素的作用,但在EDTA(pH 9.0)修复液中加入H2O2使H2O2浓度为0.75%,富含黑色素组织切片在H2O2浓度为0.75%的EDTA(pH 9.0)过氧化氢溶液中修复,修复的同时可完全去除黑色素,对组织结构和抗原性没有明显影响,不影响组织修复,后续免疫组化及HE染色得到满意的效果。

在H2O2浓度为0.75%的EDTA(pH 9.0)过氧化氢溶液中修复,高温修复的同时去除黑色素的方法操作简单方便,黑色素脱色均匀彻底,无论黑色素含量多少都可适用;组织完整性、抗原性均保留完整,减少了弱阳性和假阴性的出现;无须额外花时间脱色素,大幅缩短操作时间,避免了脱色时间、漂白时间、变化温度等不易控制因素的干扰;该方法还可省略3%H2O阻断这一步骤,节约时间减少成本,并可与不需脱色素组织同步操作;染色结束后可用酒精脱水二甲苯透明保证了切片的透明度和清晰度。值得广大病理工作者借鉴。值得注意的是过氧化氢加热易分解为H2O和O2,0.75%H2O2浓度极低不会有爆炸风险,但加热过程中仍应保持敞口加热。本实验室富含黑色素的恶性黑色素瘤标本量较少,后续还需大量实验数据进一步验证。