天然染料质谱数据库的建立与应用

寿晨超, 娜仁高娃, 高素芸, 刘 剑,3, 赵 丰,3

(1. 浙江理工大学 纺织科学与工程学院(国际丝绸学院), 浙江 杭州 310018; 2. 巴音郭楞蒙古自治州博物馆,新疆 库尔勒市 841001; 3. 中国丝绸博物馆 纺织品文物保护国家文物局重点科研基地, 浙江 杭州 310012)

天然染料是从植物、动物等天然原料中提取的可用于纺织品着色的色素,其使用在我国具有十分悠久的历史,《诗经》《齐民要术》《天工开物》等古代文献中均有记载从植物中萃取染料,并对纺织品进行染色加工[1]。常见的天然染料种类主要有吲哚类、蒽醌类、萘醌类、黄酮类、生物碱类和姜黄素类等。

通过鉴定纺织品文物中的天然染料,可了解其化学属性、植物来源、产地甚至纺织品文物年代等信息,为保护纺织品文物颜色、避免染料降解提供科学依据;此外,随着现代人们对绿色发展的理念越来越重视,筛选出优质天然染料应用于现代印染业,符合可持续发展需求。目前,用于古代纺织品染料鉴定的技术包括高效液相色谱技术(HPLC)[2]、光纤反射光谱技术(FORS)[3]、三维荧光光谱技术 (3D-EEM)[4]、高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)[5]、表面增强拉曼光谱技术(SERS)[6]等。其中高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)是最常用的检测技术,其具有强大的化合物分离和分子结构分析能力,是鉴别纺织品上天然染料的重要方法之一。然而,面对大量的纺织品文物,在使用光谱或者色谱等分析技术时,仅依靠人工已无法快速鉴别染料化合物[7]。近年来,质谱库检索技术逐渐成为研究者们关注的热点,可做为一种快速有效的鉴定方法。质谱检索软件在对未知化合物进行分析时,可将其质谱与数据库中标准物质的质谱相比对,用质谱的匹配度来衡量相似性,作为定性参考。国内外许多学者根据其实验室自身条件和检测分析目的,在农药[8]、中医药[9]、海洋寡糖[10]、人体代谢产物[11-12]等领域已建立了不同规模的质谱数据库,实现了实际样品中未知质谱的快速鉴别。在天然染料研究领域,Guo等[13]利用UPLC-MS/MS技术初步建立了用于筛选和鉴定红色天然染料化合物的质谱数据库,对红色纺织品文物进行了染料鉴定,然而其建立的质谱数据库在天然染料品种和数量上有待进一步补充。

目前,可供天然产物质谱检索匹配的数据库有美国国家标准技术研究院质谱数据库 (NIST)、代谢物质谱数据库 (Metlin)、有机化合物质谱数据库 (SDBS)、 全球天然产物社区质谱数据库 (GNPS)等[14]。其中NIST数据库的检索软件具有检索结果准确率高和检索速度快的优点[15]。本文通过对68种染料标准品进行HPLC-MS分析,利用该谱库软件建立天然染料的多级参考质谱数据库,成功匹配了2件古代纺织品文物上的染料成分,并鉴别了染料的植物来源。

1 实验部分

1.1 实验材料

HPLC级乙腈和甲醇(德国Merck公司);LC-MS级甲酸(美国Thermo Fisher公司);HPLC级吡啶(上海安谱实验科技股份有限公司);98%草酸(美国Acros有机试剂公司)。18.2 MΩ超纯水(由法国Millipore公司Millipore reference 纯水仪系统制备)。68种染料标准品,主要购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、上海源叶生物科技有限公司、美国Sigma-Aldrich公司等,纯度均在90%以上,其成分如表1所示。

表1 主要天然染料化合物标准品列表

1.2 实验仪器及条件

采用 HPLC-MS技术分析古代丝织品上的染料。其中LC20AD液相色谱系统(日本Shimadzu公司)由二元高压梯度泵、二极管阵列检测器和自动进样器组成。质谱检测器为LTQ-XL线性离子阱质谱仪(美国Thermo Fisher公司),采用Shim-pack XR-ODS C18反相色谱柱(日本Shimadzu公司)进行染料色素分离。

通过前期研究及相关文献确定对天然染料的检测分析条件[5,15],高效液相色谱洗脱液A和 B分别为0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液,流速为0.30 mL/min。质谱数据采集和处理由Xcalibur 2.1软件完成,质荷比m/z范围为100～1 000。质谱参数如下:离子喷雾电压分别为3 kV(正离子模式)和2.5 kV(负离子模式);毛细管温度为350 ℃;氮气用作鞘气和辅气,压力分别为241.32、 103.42 kPa;毛细管电压分别为35 V(正离子模式)和-40 V(负离子模式)。

数据采集和处理软件:1) Xcalibur 2.1软件(由美国Thermo Fisher Scientific开发的质谱分析软件),用于管理、处理和分析质谱数据。2)NIST MS Search 2.3软件(由美国国家标准技术研究院开发的质谱数据库搜索软件),用于快速准确地识别和鉴定未知化合物[14]。

1.3 实验方法

1.3.1 标准品溶液配制

将染料标准品超声波溶解于甲醇/水混合溶剂中,配制成质量浓度为20～400 mg/L的标准储备溶液。分析时,取适量5～10种同类别标准储备液混合,用氮气干燥后,以甲醇与水质量比为1∶1溶解至10 mg/L,移取溶液30 μL至微量进样瓶,进样15 μL。

1.3.2 文物样品制备

本文分析的2件古代丝织品分别来自于巴州博物馆收藏的汉晋时期红蓝黄三色香囊(BZ:39)和中国丝绸博物馆收藏的17世纪法国彩条花卉纹提花缎(2016-18-3)。取样品纱线0.2～0.6 mg,采用吡啶、水与草酸质量比为95∶95∶10萃取纱线上的染料,于85 ℃恒温萃取30 min,用氮气干燥后重复1.3.1节相应实验步骤。

1.4 古代纺织品中未知染料质谱识别方法

1.4.1 NIST检索算法

古代纺织品中未知染料质谱的鉴定是使用NIST MS Search 2.3软件进行谱库检索实现的。该软件的检索算法是基于点积函数,将质谱表示为1个有序的峰强度行向量,通过m/z值缩放峰强度值(每个峰值的丰度的平方根乘以m/z值的平方)。点积质谱搜索算法使用余弦相似度法,计算未知质谱向量和库参考质谱向量之间的角度余弦值来确定相似度[16]。

NIST检索结果中有正向检索匹配度(Match)、 反向检索匹配度(R.Match)和匹配概率(Prob)3个值。正向检索匹配度为将参考库的峰与未知谱对照,计算是否存在与未知谱相同的峰。反向检索匹配度为将未知谱的峰与参考库对照,计算参考谱中的各质量峰是否出现在未知谱中。在NIST检索结果中最大匹配度为999,无质谱峰匹配时为0。900及以上为优秀匹配;800～900为良好匹配;700～800为中等匹配;低于600为较差匹配。其中Prob的值是假设此化合物存在数据库中,根据命中列表中邻近命中的差别得出[16]。

1.4.2 检索参数设置

根据其它文献的实验方法,通过调节质谱搜索类型、准分子离子和子离子质量容差等搜索参数,确定最佳的谱库检索参数[11]。本文采用Simple和 MS/MS 混合搜索方法,准分子离子和子离子质量搜索参数分别设置1.6、0.8m/z的容差,忽略准分子离子附近峰设置为1.6m/z,选择主谱库(Mainlib)和自建谱库(NaturalDye)作为检索谱库。

2 结果与分析

在HPLC-MS分析纺织品中染料组分时,采用多级质谱,可以获得化合物丰富的碎片离子信息,从而能够推测染料的分子结构。天然染料质谱数据库的建立,为纺织品文物的染料鉴别提供了一种快速准确的方法。

2.1 天然染料质谱库的建立

利用线性离子阱质谱仪采集天然染料的标准品多级质谱数据,基于Xcalibur 2.1软件和NIST MS Search 2.3软件建立包含68种天然染料化合物的质谱数据库,相关信息见表2。

表2 天然染料质谱数据库的相关数据

图1示出标准品的质谱数据采集过程。首先在Xcalibur 2.1软件中选中1个色谱峰,导出染料化合物的二级质谱至NIST MS Search 2.3软件,当化合物的二级质谱碎片信息较少时需要导出其三级质谱。随后将化合物的其它信息,如名称、分子式、分子质量、别名、检测离子模式、保留时间、化学结构式输入到自建谱库中,质谱数据库存储结构如图2所示。

图1 标准品的质谱数据采集过程

图2 质谱数据库存储结构

以茜素为例,在图1导出第3个色谱峰的二级质谱信息,其相关的参数为:CAS登记号72-48-0,英文名Alizarin,分子式C14H8O4,相对分子质量240,检测离子模式为负离子模式,保留时间为13.30 min,一级质谱的准分子离子为239,二级质谱中相对强度最大的前10个子离子为m/z211(999)、m/z239(374)、m/z167(288)、m/z210(244)、m/z212(140)、m/z195(103)、m/z219(89)、m/z199(56)、m/z240(35)、m/z168(29)。

2.2 天然染料化合物的碎裂机制

为鉴定染料分子的结构,需获取MS/MS 碎裂的机制。天然染料中常见的色素多属于蒽醌类、黄酮类和生物碱类化合物,本文主要分析这3种代表性化合物的碎裂机制。

蒽醌类染料化合物是典型的红色染料来源,质谱库中记录的几种蒽醌类化合物具有相似的结构和碎裂方式。以茜素(Alizarin)为例[13](如图3、4所示),主要有茜素准分子离子[M-H]-(m/z239)及中性丢失形成的[M-H-CO]-(m/z211)、[M-H-CO2]-(m/z195)和[M-H-CO2-CO]-(m/z167)碎片离子。

图3 茜素裂解规律

图4 茜素的二级质谱图

黄酮类化合物是指2个具有酚羟基的芳环(A和B)通过三碳链连结而成的一系列C6—C3—C6化合物,是天然染料中品种最丰富的化合物种类。在多级质谱负离子模式下,易形成黄酮苷和苷元的准分子离子峰,在二级质谱中苷元会进一步裂解,产生一系列的特征性碎片离子,来源于中性丢失和环的逆狄尔斯-阿尔德裂解反应[17]。

以槲皮素为例[18],图5、6分别示出槲皮素裂解规律和二级质谱图。可以看出,在槲皮素准分子离子[M-H]-(m/z301)中存在[M-H-CO]-(m/z273)、[M-H-CO2]-(m/z257)以及 [M-H-CO2-CO]-(m/z229)碎片。槲皮素[M-H]-体系的 C 环容易发生开裂,丢失 CO形成碎片m/z257;还可在 C环跨环开裂产生m/z179、151、107 离子。

图5 槲皮素裂解规律

图6 槲皮素的二级质谱图

以木犀草素为例[19-20],图7、8分别示出木犀草素裂解规律和二级质谱图。可以看出,准分子离子峰[M-H]-(m/z285) 产生丰富的碎片离子,其裂解规律为m/z285 中性丢失形成[M-H-H2O]-(m/z267)、[M-H-CO]-(m/z257)、[M-H-C2H2O]-(m/z243)、[M-H- CO2]-(m/z241)和[M-H-C3O2]-(m/z217)碎片离子,以及[M-H-CO]-(m/z257)继续脱去C5H6O得到m/z175,[M-H-C2H2O]-(m/z243)继续脱去CO2得到m/z199。此外,[M-H]-准分子离子较易发生逆狄尔斯-阿德尔反应(RDA)裂解生成2个碎片离子m/z151和m/z133。

图7 木犀草素裂解规律

图8 木犀草素的二级质谱图

在常见的天然染料中,小檗碱、巴马汀和药根碱这3种原小檗碱类化合物是生物碱类染色植物的主要成分,且它们的裂解规律也十分相似。以小檗碱为例[21-22],图9示出其裂解规律和二级质谱图。可以看出,小檗碱[M+H]+(m/z336)准分子离子中性丢失形成[M+H-CH3]+·(m/z321)碎片离子,进一步脱去CH3·形成m/z308碎片,或脱去H·形成[M+H-CH3-H]+·(m/z320)碎片,接着再脱去1个CO形成m/z292碎片。

图9 小檗碱裂解规律及二级质谱图

2.3 天然染料质谱数据库的应用

本文采用HPLC-MS对2件纺织品文物进行染料检测,利用上述建立的天然染料质谱数据库进行质谱比对,鉴定染料化合物。

图10(a)示出巴州红黄蓝三色香囊的红色丝线样品碎片。在染料鉴定中,首先将图10(b)色谱峰1(保留时间为13.38 min)对应的二级质谱导出至NIST MS Search 2.3软件,如图10(c)所示点击“Library Search”按钮进行质谱库检索,检索结果显示色谱峰1的质谱与数据库中茜素质谱的匹配度最高,正向检索匹配度(Match)为884,反向检索匹配度(R. Match)为892,匹配概率(Prob)为98.1%。色谱峰2(保留时间为14.44 min)的质谱与茜紫素质谱的匹配度同样优秀,3个匹配项数据Match值为906,R.Match值为911,Prob值为98.6%。结合未知化合物和标准品的保留时间比对,证实了茜素和茜紫素的存在,说明红色织物碎片由西茜草(rubia tinctorum)染色。

注:图(c)、(d)中横坐标为质荷比,纵坐标为相对丰度。

图11示出巴州红黄蓝三色香囊中黄色丝线碎片文物样品鉴定结果。在对香囊淡黄色织物碎片的染料鉴定中,质谱库检索结果显示色谱峰1(保留时间为8.47 min)和色谱峰2(保留时间为9.21 min)对应的质谱分别与数据库中药根碱和小檗碱的质谱相匹配。检索结果显示3个匹配项数据Match值为917、R.Match值为917、Prob值为98.8%和 Match值为843、R.Match值为844、Prob值为99.0%。结合未知化合物和标准品的保留时间对比,确认织物碎片中含有这2种物质,均为小檗属植物(berberis spp.)的主要色素成分。

注:图(c)、(d)中横坐标为质荷比,纵坐标为相对丰度。

图12示出法国彩条花卉纹提花缎中黄色丝线文物样品鉴定结果。在对黄色丝线的染料鉴定中,通过质谱库检索,色谱峰1(保留时间为10.51 min)

注:图(c)、(d)中横坐标为质荷比,纵坐标为相对丰度。

对应的质谱与数据库中木犀草素的质谱相匹配,3个匹配项数据Match值为829,R.Match值为840, Prob值为98.7%。色谱峰2(保留时间为11.56 min)对应的质谱与芹菜素的质谱相匹配,3个匹配项数据Match值为802,R.Match值为804,Prob值为98.2%。推测黄色丝线由木犀草(reseda luteola)染色。

3 结 论

采用高效液相色谱-质谱联用技术分析了68种天然染料化合物,建立了常见天然染料的质谱数据库,应用该数据库鉴定了2件古代纺织品中的天然染料化合物。巴州红黄蓝三色香囊中的红色碎片含有茜素和茜紫素,经分析为西茜草染色;黄色碎片含有小檗碱和药根碱,经分析为小檗属植物染色。法国彩条花卉纹提花缎黄色纱线中含有木犀草素和芹菜素,经分析为木犀草染色。

本文建立的天然染料质谱库可在正负离子检测模式下工作,且在实际文物样品的检索结果中正反向检索匹配度均达到800以上,匹配率达95%以上,实现了纺织品文物染料的快速准确鉴别,减少了对标准品的依赖,降低了实验室的运行成本,证明了质谱库检索技术应用于天然染料鉴定的可行性和潜力。但是,目前建立的天然染料质谱数据库中染料品种有待扩充,且不能良好匹配不同品牌仪器产生的质谱数据,下一步可结合机器学习继续开发检索算法,提高谱库的兼容性和可用性。