斜叶黄檀HPLC 指纹图谱及含量测定研究

覃川娴，何泽源，黄清霞，韦建华，冯 旭

（1.广西中医药大学 药学院，广西 南宁530200；2.广西高校中药提取纯化与质量分析重点实验室，广西 南宁530200）

斜叶黄檀Dalbergia pinnata(Lour.) Prain 为豆科黄檀属植物，又名羽叶檀、罗望子叶黄檀、斜叶檀，主产于海南、广西、云南及西藏等地区。最早收录于《云南药用植物名录》，记载其根可消炎解毒、截疟、治疟疾[1]。《中国植物志》中记载其“全株药用，治风湿、跌打、扭挫伤，有消肿止痛之效”[2]。我国海南、云南等民间将其外用于跌打损伤、刀伤、烫伤等，亦可内服用于治疗心血管疾病和糖尿病等疾病，具有悠久的民间药用历史[3]。现代研究表明，斜叶黄檀中主要含有黄酮类、挥发油类、甾醇类及三萜类等成分[4-6]，具有抗炎、抗氧化、抗菌、褪黑等作用[7-8]。

目前有关斜叶黄檀的研究报道较少，主要集中在品种鉴定、化学成分分析以及药理作用等方面。在质量标准研究方面，有学者对斜叶黄檀进行性状、显微鉴别，并利用薄层色谱法、气相色谱法等对斜叶黄檀中的挥发油进行检测分析，但未对其他成分进行研究[9]。本研究采用HPLC 法建立斜叶黄檀指纹图谱并同时测定原儿茶酸、桂皮鞣质B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷和芒柄花素4 种成分的含量，以期为斜叶黄檀的质量控制提供一定的参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（VWD 检测器，美国安捷伦科技公司）；Agilent 1100 Series 型高效液相色谱仪（DAD 检测器，美国安捷伦科技公司）；XSR205 型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。

1.2 试药与试剂

原 儿 茶 酸（ 纯 度＞98%， 批 号：GR-138-011006）、芒柄花素（纯度＞98%，批号：GR-138-024504）均购于南京广润生物制品有限公司；桂皮鞣质B1（纯度＞98%，批号：20221013）购于成都草源康生物科技有限公司；芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷（归一化法计算纯度＞98%）为实验室自制。乙腈、甲醇均为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为超纯水。10 批斜叶黄檀药材经广西中医药大学中药鉴定教研室廖月葵高级实验师鉴定，均为豆科黄檀属植物斜叶黄檀Dalbergia pinnata(Lour.) Prain 的根茎。阴干，打粉，过二号筛。药材来源见表1。

表1 斜叶黄檀药材来源Tab.1 Source of Dalbergia pinnata (Lour.) Prain medicine

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Inertsil ODS-3 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0 ～ 18 min，10% → 13%A；18 ～ 23 min，13% →15%A；23 ～ 43 min，15% →19%A；43 ～ 67 min，19% →25%A；67 ～ 112 min，25% →45%A）；流速为1.0 mL/min；检测波长为254 nm；柱温为25℃；进样量为10 μL。

2.2 供试品溶液的制备

取斜叶黄檀药材1 g，精密称定，精密加入55%乙醇10 mL，超声处理70 min，用55%乙醇补重，摇匀，取续滤液，即得。

2.3 混合对照品溶液的制备

精密称取各对照品适量，用甲醇溶解并定容，制成每毫升含原儿茶酸3.94 μg、桂皮鞣质B1 1 108.29 μg、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷223.85 μg、芒柄花素8.56 μg的溶液。

2.4 斜叶黄檀指纹图谱研究

2.4.1 精密度试验 取同一批斜叶黄檀药材粉末（S1），制成供试品溶液，按“2.1”项下条件连续进样6 次，以5 号峰（桂皮鞣质B1）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD 分别小于0.33%和2.2%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取同一批斜叶黄檀药材粉末（S1），制成供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”项下条件进样测定，以5 号峰（桂皮鞣质B1）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD 分别小于0.99%和2.8%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取同一批斜叶黄檀药材粉末（S1）6 份，制成供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定，以5 号峰（桂皮鞣质B1）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD 分别小于0.28%和2.8%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 指纹图谱的建立 取10 批斜叶黄檀药材，制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，将10 批斜叶黄檀药材所得图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，以S1 斜叶黄檀药材图谱为参照图谱，生成10 批斜叶黄檀药材的叠加图谱，确定了13 个共有峰，并通过对照品保留时间和紫外光谱对比，确认了1、5、10、13 号峰分别为原儿茶酸、桂皮鞣质B1 、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷和芒柄花素，见图1、2。

图1 10 批斜叶黄檀供试品叠加色谱图Fig.1 Superimposed chromatograms of 10 batches of Dalbergia pinnata (Lour.) Prain samples

图2 混合对照品(A)和斜叶黄檀供试品(B)色谱图Fig.2 HPLC of mixed reference substance(A) and Dalbergia pinnata (Lour.) Prain sample(B)

2.4.5 相似度评价 以5 号峰（桂皮鞣质B1）为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间见表2，相对峰面积见表3。10 批斜叶黄檀药材的相似度分别为0.990、0.990、0.993、0.967、0.983、0.990、0.994、0.997、0.995、0.990。

表2 共有峰相对保留时间Tab.2 Relative retention time of common peaks

表3 共有峰相对峰面积Tab.3 Relative peak area of common peaks

2.4.6 聚类分析 将10 批次斜叶黄檀药材13 个共有峰的峰面积从中药相似度软件导出，整理后导入SPSS（21 版）软件进行聚类分析，结果见图3。10批斜叶黄檀药材以10 平方欧氏距离为准可细分至三类：S6 单独为第一类；S5、S9 为第二类；S1 ～ S4、S7、S8、S10 为第三类。表明不同产地的斜叶黄檀共有峰含量之间存在一定的差异。

图3 聚类分析图Fig.3 Cluster analysis diagram

2.4.7 主成分分析 以10 批次斜叶黄檀药材的13个共有峰峰面积为变量，使用SPSS（21 版）软件进行主成分分析，提取得到3 个主成分，累积方差贡献率为89.943%，见表4。载荷矩阵结果显示，色谱峰5（桂皮鞣质B1）、色谱峰8、色谱峰9 在主成分1 上有较高载荷；色谱峰2 在主成分2 上有较高载荷；色谱峰10（芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷）、色谱峰13（芒柄花素）在主成分3 上有较高载荷。建立以主成分1、2、3 的空间散点坐标系得PCA 得分图，其结果与聚类分析（以10 平方欧氏距离）相一致，见图4。

图4 PCA 得分图Fig.4 PCA score chart

表4 主成分的初始特征值和贡献率Tab.4 Principal component analysis of eigenvalue and variance contribution rate of samples

2.5 斜叶黄檀含量测定研究

2.5.1 线性关系考察及检测限、定量限 取不同体积的混合对照品溶液，用甲醇配制成不同的浓度，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以对照品浓度作为横坐标，峰面积作为纵坐标建立各成分的线性回归方程；逐级稀释标准品溶液，按信噪比（S/N=3）计算各成分的检测限；按信噪比（S/N=10）计算各成分的定量限。结果见表5。

表5 4 种成分的线性关系及检测限、定量限Tab.5 Linearity of 4 components and LOD， LOQ

2.5.2 精密度试验 取“2.3”项下混合对照品溶液连续6 次进样，计算得到原儿茶酸、桂皮鞣质B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素各成分峰面积RSD分别为0.96%、0.18%、0.68%、0.48%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 同“2.4.2”项下方法，计算得到原儿茶酸、桂皮鞣质B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素各成分峰面积RSD 分别为1.10%、0.40%、0.51%、0.44%，表明该方法在24 h 内基本稳定。

2.5.4 重复性试验 同“2.4.3”项下方法，计算得到原儿茶酸、桂皮鞣质B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素各成分含量RSD 分别为1.60%、1.20%、0.75%、0.46%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验 取已知各成分含量的斜叶黄檀粉末（S1）6 份，每份约0.5 g，精密称定，大约按1 : 1 比例加入混合对照品溶液，按“2.2”项下方法制备，按“2.1”项下条件测定，计算得到原儿茶酸、桂皮鞣质B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素各成分平均加样回收率分别为103.79%、103.26%、96.22%、104.06%，RSD 分别为1.2%、1.3%、2.8%、1.2%，结果表明方法准确可行。结果见表6。

表6 斜叶黄檀中4 种成分加样回收试验结果（n = 6）Tab.6 Recovery experiment of 4 components in Dalbergia pinnata (Lour.) Prain by sample addition(n = 6)

2.5.6 样品含量测定 取10 批斜叶黄檀药材制备成供试品溶液，分别测定，计算各产地原儿茶酸、桂皮鞣质B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、芒柄花素成分的含量，结果见表7。

表7 10 批斜叶黄檀中4 个成分的测定结果（μg/g, n = 3）Tab.7 Measurement results of 4 components in the 10 batches of Dalbergia pinnata (Lour.) Prain (μg/g, n = 3)

3 讨论

本研究采用HPLC-DAD 进行全波长扫描发现，在254 nm 波长下原儿茶酸、桂皮鞣质B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷和芒柄花素均有较强的紫外吸收，色谱峰峰型较好且杂峰干扰较少，因此确定254 nm 为检测波长。并对不同流动相（甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%乙酸）、色谱柱（Inertsil 柱、Waters 柱、Phenomenex 柱、FeniGen 柱）、柱温（20、25、30、35、40℃）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、进样量（5、10、15 μL）进行考察，结果发现采用Inertsil ODS-3 色谱柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，流速：1.0 mL/min，柱温：25℃，进样量：10 μL，所得色谱峰的分离效果最好。

本研究建立的10 批斜叶黄檀HPLC 指纹图谱，相似度均大于0.900，由于本实验收集的斜叶黄檀药材均来自广西地区，表明该地区斜叶黄檀药材质量差异较小，药材质量总体较为稳定。聚类分析和主成分分析结果显示，10 批次斜叶黄檀以10 平方欧氏距离为准可分至三类，表明不同产地的斜叶黄檀共有峰含量之间存在一定的差异，可能受生长环境、生长年限、采收期等影响。

根据10 批不同产地斜叶黄檀的含量测定结果分析，广西区内不同产地斜叶黄檀中的原儿茶酸、桂皮鞣质B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷和芒柄花素含量存在一定的差异。其中，不同产地的斜叶黄檀药材中4 种成分均以桂皮鞣质B1 的含量最高，均占其总含量的70%以上，推测桂皮鞣质B1 含量对斜叶黄檀药材质量影响较大，可考虑作为评价斜叶黄檀药材质量的指标之一。

4 结论

本研究建立的斜叶黄檀HPLC 指纹图谱以及对原儿茶酸、桂皮鞣质B1、芒柄花素-7-O-β-D-呋喃芹糖基-(1 →6)-β-D-吡喃葡萄糖苷和芒柄花素4种成分的含量测定方法，能有效分析不同产地的斜叶黄檀药材的质量差异，为进一步研究其药效关系和质量控制提供参考。但研究所用的斜叶黄檀均来源于广西地区，存在样品批次较少、代表性不够等问题，后续可将其有效成分作为指标对其他地区斜叶黄檀进行研究，进而为斜叶黄檀药材的质量控制提供依据。