防风药材质量调查研究

姚 瑶，于鹏程，宋孝文，赵 楷，关 瑜，孟祥才

（黑龙江中医药大学 药学院,黑龙江 哈尔滨 150040）

防风为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根，具有祛风解表、胜湿止痛、止痉的功效，用于治疗感冒头痛、风湿痹痛、风疹瘙痒、破伤风等[1]。防风喜光、耐旱、耐寒，适应性很强[2]，分布区域广，不同产地药材质量相差较大。2020 年版《中国药典》规定，防风中的升麻素苷和5-O- 甲基维斯阿米醇苷两种色原酮的总量不得少于0.24%[1]，对不同产地防风质量分析表明升麻素苷和5-O- 甲基维斯阿米醇苷含量差异较大。种质和环境是影响药材质量的最主要因素[3]。防风依据种质可分为水防风与关防风，水防风指的是河北及内蒙古赤峰种子所种植的防风，而关防风指的是黑龙江及内蒙古种子所种植的防风，两者为防风植物的不同生态型，其中关防风质量较佳，但产量较低。干旱是影响药材质量的主要生态因子[4]，防风主要生长在干旱地区，为典型的阳性植物，主产于我国东北地区和华北地区，黑龙江种植面积占全国种植面积的50%以上，以黑龙江和内蒙古产量最大[5]。为此，本文对防风药材质量进行调查研究，分析药材质量形成因素，以期为优质药材生产提供指导。

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料

42 批防风样品来源信息见表1，经黑龙江中医药大学孟祥才教授鉴定为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根。

表1 防风样品信息Tab.1 Radix Saposhnikoviae sample information

1.2 仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国 Waters 公司）；CPA225D 型精密分析电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.3 试剂

升麻素苷（批号：111522-202214，纯度：95.7%）、升麻素（批号：111710-200602，纯度≥98.0%）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号：111523-202212，纯度：97.8%）、亥茅酚苷（批号：111714-200501，纯度≥98.0%），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯，美国迪马公司）、娃哈哈纯净水、甲醇（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司）。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取升麻素苷、升麻素、5-O- 甲基维斯阿米醇苷及亥茅酚苷对照品适量，分别加甲醇溶解并定容制成含量为3.784 mg/mL、0.424 mg/mL、3.488 mg/mL、0.208 mg/mL 的对照品贮备液，精密量取上述各对照品贮备液1 mL 置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取防风粉末（过60 目筛）0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，称定重量，水浴回流2 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.2 色谱条件

DIKMA C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇（A）-水（B）为流动相进行梯度洗脱，0 ～8 min，30%→50%A；8 ～ 18 min，50%→70%A；18 ～30 min，70%A。柱温：40℃；流速：1.0 mL/min；二极管阵列(PDA)检测器检测波长：254 nm；进样量：10 μL。色谱图见图1。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密量取“2.1.1”项下制备的各对照品贮备液0.05、0.1 、0.2、0.4 、0.6、0.8、1、1.2 mL，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度。分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，以浓度（X，μg/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，结果见表2。结果表明，升麻素苷、升麻素、5-O- 甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷在各自浓度范围内线性关系良好。

表2 色原酮成分的线性关系考察结果Tab.2 Investigation results of linear relationship of chromone components

2.3.2 精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下制备的溶液，重复进样6 次，进样量10 μL。升麻素苷、升麻素、5-O- 甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷峰面积的RSD 值分别为1.35%、1.63%、1.25%、1.67%，均小于2.0%，表明该仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取42 号防风样品粉末，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，并按“2.2”项下的进样条件进行测定，升麻素苷、升麻素、5-O- 甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷含量的RSD 分别为0.28%、2.75%、1.07%、2.79%，均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取42 号防风样品粉末，按“2.1.2”项下方法制成供试品溶液，在室温放置12 h，分别于0、3、6、9 和12 h 进行测定。升麻素苷、升麻素、5-O- 甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷峰面积的RSD 分别为1.76%、1.78%、0.79%、1.64%，均小于3.0%，表明供试品溶液在12 h 内稳定。

2.3.5 加样回收率试验 取9 号防风样品粉末，分别添加升麻苷、升麻素、5-O- 甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰面积并计算加样回收率，结果见表3，表明该方法回收率良好。

表3 加样回收率试验结果（mg，n = 6）Tab.3 Result of sample recovery tests（mg，n = 6）

2.4 统计学方法

采用SPSS 26.0 软件进行数据统计和分析，对其进行聚类分析、Pearson 相关性分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 色原酮成分含量测定

3.1.1 色原酮成分含量测定结果 精密称定防风药材粉末适量，按“2.1.2”项下制备供试品溶液，后按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰面积并计算样品含量。结果见表4。

表4 防风色原酮含量测定结果（mg/g，n = 3）Tab.4 Determination results of Radix Saposhnikoviae chromone content（mg/g ，n = 3）

所收集的42 份防风样品中，齐齐哈尔泰来县所产的4 年生防风色原酮总含量最高，为22.29 mg/g，佳木斯市望江郊区3 年生防风色原酮总含量最低，仅为4.10 mg/g。

3.1.2 防风色原酮含量分布情况 2020 年版《中国药典》（一部）中规定升麻素苷和5-O- 甲基维斯阿米醇苷的总量不得少于0.24%，即2.4 mg/g。以2.4 mg/g 为一个单位，对42 批防风中升麻苷和5-O- 甲基维斯阿米醇苷的总量进行统计，结果有36 批药材两种成分总量超过0.48%，是《中国药典》限度的2倍(占检测份数的85.7%)；30 批药材两种成分总量超过0.72%，是《中国药典》限度的3 倍(占检测份数的71.4%)；有14 批药材两种成分总量超过0.96%，是《中国药典》限度的4 倍(占检测份数的33.3%)；最高含量是《中国药典》限度的7.8 倍；另从升麻素苷、5-O- 甲基维斯阿米醇苷、升麻素和亥茅酚苷四种成分的总量分析，也具有相同的分布趋势，见表5。

表5 42 批防风色原酮含量分布表Tab.5 Distribution of content of 42 batches of Radix Saposhnikoviae chromone

3.2 聚类分析结果

使用SPSS 26.0 软件对42 批药材测定结果通过欧式距离平方计算样品间相似系数，用平均联接（组间）聚类分析，结果见图2。42 批样品一共分为2 大类，其中，32、40 号样品为一类，其余均属于另一类。当阈值λ= 5 时，每一大类又分为两小类，其中，12 ～14、19、23、27、29、3、37、42 号防风样品为第二类群；32 号样品为第三类群、40 号样品为第四类群；其余的防风样品均归属于第一类群。

图2 42 批不同产地防风药材中4 种色原酮成分含量聚类分析树状图Fig.2 Cluster analysis dendrogram of the contents of four chromones in 42 batches of Radix Saposhnikoviae materials from different origins

3.3 土壤因素对防风中色原酮含量的影响

根据Pearson 相关性分析得出，土壤因素与升麻素苷、5-O- 甲基维斯阿米醇苷、色原酮总含量之间的相关系数分别为0.348（Sig = 0.000）、0.241（Sig =0.007）、0.302（Sig = 0.001），均呈现出0.01 水平的极显著差异，这一结果表明升麻素苷成分及5-O- 甲基维斯阿米醇苷成分及色原酮总成分与土壤因素之间具有极显著的正相关关系，但土壤因素对于升麻素及亥茅酚苷的影响并不显著。土壤对于色原酮总含量影响均显示沙土（平均含量为11.417 1±4.755 5 mg/g）优于火山灰土（平均含量为10.030 0±0.252 4 mg/g），显著优于黑土（平均含量为8.638 7±3.123 5 mg/g）（P＜0.05）。不同土壤类型的物理结构影响着植物根系的生长发育，一般土壤砂性越强，越容易造成干旱的环境，而干旱通常是影响药材质量的主要因素，这可能是沙质土壤含量高的本质原因[6]。

3.4 生长年限对防风中色原酮含量的影响

5-O- 甲基维斯阿米醇苷、升麻素、色原酮总含量与生长年限的相关性系数分别为0.347（Sig =0.000）、0.319（Sig = 0.001）、0.339（Sig = 0.001），结果表明不同生长年限下的防风其5-O- 甲基维斯阿米醇苷含量、升麻素含量以及色原酮总含量存在极显著差异（P＜0.01），且与生长年限这一因素均存在正相关性；升麻素苷含量、亥茅酚苷含量与生长年限的相关性系数为0.213（Sig = 0.034）、0.226（Sig =0.024），两者与生长年限因素均存在0.05 水平上的弱相关关系。上述结果表明，生长年限这一因素对于防风品质的影响还是较为重要的，根据不同年限下防风的色原酮总含量进行排序为4年生＞3年生＞2年生。

3.5 种质对防风中色原酮含量的影响

种质因素也是影响药材质量的重要原因之一[7]。本试验分析得出，5-O- 甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚苷含量与种质因素的相关性系数分别为为0.325（Sig = 0.000）和0.240（Sig = 0.007），说明种质因素对这两种成分含量的影响极为显著，而且均表现为关防风含量明显高于水防风（P＜0.01），但种质因素对升麻素苷及升麻素成分含量的影响差异无统计学意义（P＞0.05）。种质因素与色原酮总含量之间的相关系数为0.224（Sig = 0.012），表明种质因素对色原酮总含量具有明显影响（P＜0.05）。

3.6 生产方式对防风中色原酮含量的影响

3.6.1 栽培方法对防风色原酮含量的影响 升麻素苷含量与栽培方式的相关性系数为0.211（Sig =0.026）；5-O- 甲基维斯阿米醇苷含量与栽培方式的相关性系数为0.321（Sig = 0.001）；色原酮总含量与栽培方式的相关性系数为0.296（Sig = 0.002）。说明5-O- 甲基维斯阿米醇苷及色原酮总含量与栽培方式具有极显著性弱相关（P＜0.01），升麻素苷、色原酮总含量与栽培方式具有显著性弱相关（P＜0.05），均为直播方式下的成分含量较高。

有研究表明，移栽防风中色原酮含量为直播防风的2 倍[8]，本研究中的试验结果与之前文献中的结论不同，分析原因可能是本试验中的防风为主根，而之前研究中的防风样品包括了含量较高的侧根。侧根韧皮部比例较大，侧根中的有效成分含量通常较高[9-10]，研究显示移栽防风侧根（升麻素苷0.806%，5-O- 甲基维斯阿米醇苷0.573%）的含量显著高于全根（升麻素苷0.453%，5-O- 甲基维斯阿米醇苷0.452%）[11]，由此可以推断防风侧根的含量高于主根。在此次试验中，有4 份样本为河北防风，河北秧播防风中升麻素苷含量约为直播防风，而升麻素及亥茅酚苷的含量则是直播高于秧播，其中就升麻素含量而言直播防风约为秧播防风的2 倍。

3.6.2 野生与栽培防风色原酮含量的差异 前期研究表明，野生防风药材较栽培品防风质量佳[12-13]，但本次研究中，有些野生防风中色原酮总含量并不高于栽培品，甚至低于4 年生的栽培防风。就升麻素苷而言，春季采收防风中的含量(7.16 ± 0.29 )mg/g高于夏季(3.33 ± 0.34 )mg/g (P＜0.01);春季采收防风色原酮含量（12.64 ± 0.45） mg/g 较夏季采收的防风色原酮含量(7.25 ± 0.87) mg/g 同样有极显著性差异(P＜0.01)。5-O- 甲基维斯阿米醇苷是防风药材中含量较高的色原酮成分，目前仍作为防风质量的评价指标，但研究显示该成分在肠道和血液中极不稳定，很快分解[14]，因此，5-O- 甲基维斯阿米醇苷并不适合作为防风药材质量的指标。以往研究显示，升麻素苷具有较强的药理作用，野生防风化学成分特征是升麻素苷比例较高，升麻素苷与5-O- 甲基维斯阿米醇苷二者的比值为1.29 : 1，而栽培防风的比值为0.29 :1[12]。如果去除5-O- 甲基维斯阿米醇苷成分含量，春季采收防风色原酮含量（8.753 3 ± 0.442 6 mg/g）显著高于夏季(3.898 3 ± 0.509 4) mg/g（P＜0.01），特别是活性更高的升麻素和亥茅酚苷尤为显著。黑龙江省防风主产区春季气候干旱，夏季多雨，而且传统上野生防风的采收季节主要是春季，这可能是野生防风质量佳的主要因素。

4 讨论

本研究的聚类分析结果表明，黑龙江省所产防风的质量与产地存在一定关系，产于黑龙江省西南部的防风药材质量多优于黑龙江省东部及河北省所产的防风质量，大庆市与齐齐哈尔市产区在质量上更为接近，而佳木斯市、双鸭山市种植出的防风质量更为接近，黑河市防风质量差异不大，但是大庆市区与大庆市林甸县所产防风分属不同类群，质量有一定差异，分析可能是由于大庆林甸县产区具有道地产区优势，其土质等外在环境适宜防风药材生长。

防风作为我国药材市场流通的大宗药材，也是东北地区的重要代表药材之一，其中，升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷因其含量较高故作为2020 年版《中国药典》规定的含量测定指标。有效成分的药效是由化合物的主要活性基团决定的，升麻素为升麻素苷的苷元，较升麻素苷多一个-OH，而且升麻素缺少亲水性葡萄糖基，更易透过细胞膜而被吸收入血，因此生物利用度也较高，其药理作用约是升麻素苷的4 倍左右[15]。亥茅酚苷也比升麻素苷多1 个-OH，具有显著的抗炎、镇痛疗效[16]，因此在试验中同样将这两种色原酮成分作为探究对象。本研究结果表明，防风中的升麻素含量与采收季节以及生长年限具有一定关系，而亥茅酚苷的含量与种质、生长年限等因素相关联。防风药材品质形成过程中影响因素众多[17]。为了获得质量稳定、疗效可靠的防风药材，有必要综合土壤、种质以及生产方式等多方面因素进行考量，从而保证用药的安全与疗效。

5 结论

本试验对于42 批防风药材进行含量测定，在先前的色谱条件基础上作了进一步优化，该方法稳定性、重复性及重现性均良好，在此基础上结合聚类分析及多成分同时测定，协同多指标定量评价，不仅为防风药材两种不同基原(关防风、水防风)的特异性、差异性研究提供了科学依据，同时也为防风的质量控制提供优化方案，从而为今后防风的生产实践以及种质开发提供依据。