L-10BPA中间体合成工艺优化及连续流可行性工艺研究

＊关东 董珍 陈凯 李国威 廖竞远 黄均荣 游恒志*

（1.深圳市中核海得威生物科技有限公司 广东 518057 2.哈尔滨工业大学（深圳） 广东 518055）

引言

硼中子捕获疗法（Boron Neutron Capture Therapy，BNCT）是一种新兴的二元靶向治疗方式，旨在改善传统上难以治疗肿瘤的治疗率。其原理是将对肿瘤有特异性亲和力的10B化合物注入人体，经中子束局部照射使聚集在肿瘤组织中的10B与热中子发生核反应，利用生成的7Li与α粒子破坏肿瘤组织[1-2]。α粒子的范围很短，优先影响肿瘤组织，同时避免更远端的正常组织受到损伤。目前，L-10BPA是已知可利用BNCT治疗癌症的重要硼化物[3]。富含10B的L-BPA的合成方法已有许多文献报道，但现有技术都存在成本较高，合成条件苛刻等缺陷[4]，因此需要成本低、合成条件温和的合成方法。本研究拟参考前人路线，在其基础上设计正交实验优化釜式反应条件，对釜式反应的条件进行优化，并根据釜式参数探讨了连续流合成技术的可行性，连续流工艺对于金属有机试剂在反应过程中放出的大量热能以微热的形式排出体系之外，可降低危险性以及反应的放大效应[5]。

1.实验材料

（1）主要仪器。Agilent 1260高效液相色谱：美国Agilent公司；ME204E电子天平（万分之一）：梅特勒-托利多公司；IKA RV3 eco旋转蒸发仪：德国IKA公司；震荡式连续流微通道反应器：深圳一正科技有限公司。（2）主要试剂。N-叔丁氧羰基-4-碘-L-苯丙氨酸、异丙基氯化镁（2M in THF）、硼酸三正丁酯；硼-10酸，深圳中核海得威生物科技有限公司；其他试剂和溶剂均为市售分析纯。

2.实验方法

（1）釜式反应制备L-BPA中间体。合成路线如图1所示。首先，精确称量1.00g（16.17mmol，1eq.）硼酸加入反应瓶中，加入磁子，称量5.40g（72.77mmol，4.5eq.）正丁醇加入反应烧瓶中，搅拌均匀。室温条件下将31.72mg（0.32mmol，0.02eq.）浓硫酸加入反应体系中。搭建回流装置，常压条件下油浴升温至130℃，搅拌反应4h，将反应过程生成的水分分出，馏出的水体积不再增加且水的总体积与理论计算体积相近，常压条件下油浴升温至170℃，将反应体系中未反应完全的正丁醇蒸馏出来，至馏出体积不再变化且正丁醇馏出总体积和理论计算体积相近。将反应体系降温至50℃，油泵开启稳定后接入蒸馏装置中，抽真空条件下将反应体系升温至110℃，分出硼-10酸三正丁酯，至最终无馏分蒸出且反应瓶中无液体，收集得到3.1850g无色透明液体立即密封。精确称量1.00g（2.55mmol，1eq.）的N-叔丁氧羰基-4-碘-L-苯丙氨酸，将其加入到schlenk管中，加入磁子，密封schlenk管，抽真空，置换氮气循环3次。室温下加12.5mL的无水THF，搅拌溶解后置于-30℃下预冷10min，使反应体系温度降低至-30℃。在30min内缓慢滴加完10mL（20.4mmol，8eq.）异丙基氯化镁（2.0M in THF），继续在-30℃条件下反应4h。再往体系中缓慢滴加0.85mL（3.19mmol，1.25eq.）的硼酸酯，继续在-30℃下反应过夜，TLC监测反应完成情况。待底物N-叔丁氧羰基-4-碘-L-苯丙氨酸完全反应后加入38.25mL纯水淬灭反应，搅拌10min，溶液凝固，取出schlenk管置于室温，搅拌。固体消失后，缓慢滴加38.25mL（1mol/L）稀盐酸，搅拌2h，溶液逐渐变澄清透明。使用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，真空下旋转蒸发除去溶剂，抽真空，完全除去溶剂，得到粗产品0.86g。最后，快速反相柱层析分离，得到0.496g白色粉末纯产物，产率63%。

（2）连续流式反应制备L-BPA中间体。连续流式反应合成路线如图2所示。首先，取下注射器，并在流路A，B，C三处同时以氮气吹扫10min，排除体系中水氧。精确称量0.6mmol的N-叔丁氧羰基-4-碘-L-苯丙氨酸234.72mg，以THF为溶剂配制4.8mL溶液，接入流路A；量取异丙基氯化镁溶液（1Min THF）4.8mL，接入流路B；精确称量0.75mmol硼酸酯172.62mg，以THF为溶剂配制9.6mL溶液，接入流路C；同时以25μL/min的流速注入流路A，B，使两者在反应器1中进行反应；以50μL/min的流速注入流路C，在反应器2中与第一步反应产物进行硼酯化，流出液后处理与釜式反应一致。

图2 连续流式反应过程示意图

3.实验结果与讨论

（1）釜式反应实验条件优化。通过前期调研，本研究选取了格氏试剂、硼酸酯、溶剂、温度进行了实验设计，对每个因素分别设置了3个水平，以分析这四个因素不同水平分布对结果的影响，如表1所示。

表1 L9（34）正交实验表及结果

从以上分析可得，影响产物合成的因素贡献顺序为A＞B＞C＞D，即格氏试剂的用量＞硼酸酯的用量＞温度＞溶剂的量。格氏试剂和硼酸酯当量的变化对于反应的产率影响较大，格氏试剂的当量对结果影响最为显著。综上，最优的釜式反应条件为：格氏试剂8当量，硼酸正丁酯1.25当量，温度为-30℃，溶剂THF为0.2mol/L。最佳反应条件在9组实验中并没有出现。在此条件下，重复3次验证实验，得到的实验产率分别是75%、78%及76%，证明了正交实验的准确性。

（2）釜式反应后处理条件优化。本文还探究了后处理时酸化的反应条件，结果如表2所示。

表2 后处理优化研究

实验结果表明，当使用不同浓度的盐酸时，0.5mol/L的HCl在酸化2h后得到63%的产率，随着稀盐酸浓度的逐渐提升（1～2mol/L），分离产率开始下降。这可能是由于在此盐酸浓度（1～2mol/L）下2h的搅拌时间过长，导致Boc基团脱落，目标产物减少。而使用浓盐酸搅拌1h，实验分离产率为52%，可能是浓盐酸酸化1h太剧烈导致生成了副产物，目标产物产率不高。

（3）连续流工艺的结果。根据上述釜式反应得到的较优实验条件，同时根据连续流工艺的特点及图2所示的实验装置和条件进行连续流式反应，分别合成了天然B和10B同位素的L-BPA中间体(S)-Boc-4-二羟基硼基-苯丙氨酸。在连续流式反应下，克级反应实验的分离产率为57%，反应时间2h。所获得产物通过核磁共振图谱进行了定性表征。用氘代DMSO作溶剂，采用1H NMR和13C NMR表征了目标产物，核磁图及高分辨质谱图结果示于图3。高分辨质谱显示，天然B（测试值为：C14H2011BNNaO6+=332.1289；计算值为：C14H2011BNNaO6+=332.1276）和10B同位素（测试值为：C14H2010BNNaO6+=331.1318；计算值为：C14H2010BNNaO6+=331.1212）的实验结果与计算结果吻合，证明合成产物确为目标分子。

4.结论

L-10BPA在BNCT治疗肿瘤方面有着极其重要的应用价值，是目前市场上唯一一种使用BNCT技术治疗肿瘤的同位素硼药。本研究通过设计正交实验优化了釜式反应的条件，并且对反应后处理和提纯方式进行了优化。该方法制成的L-10BPA中间体克级反应分离收率63%，而且通过连续流技术可以实现L-10BPA中间体(S)-Boc-4-二羟基10硼基-苯丙氨酸的连续和快速合成，连续流式反应实验的分离收率57%。本研究为进一步工业化放大生产L-10BPA提供了基础。