瓜蒌薤白对高脂血症小鼠肝脏三酰甘油合成及SIRT1/AMPK通路的影响

2023-12-20王雨婷李正龙张文龙许添阳谢宜瑜王清萍吴冰雨吴鸿飞

安徽中医药大学学报 2023年6期

刘洁,王雨婷,李正龙,张文龙,许添阳,谢宜瑜,王清萍,陈颖,吴冰雨,吴鸿飞

(安徽中医药大学药学院中药研究与开发安徽省重点实验室,安徽合肥 230012)

高脂血症是一种脂质代谢异常导致的疾病,其主要临床表现为患者血清三酰甘油(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)升高或高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)降低[1],以TG的升高最为常见[2]。研究[3]表明,血清TG水平与心血管疾病死亡率之间存在剂量依赖关系,可作为诊断、预测心血管疾病的依据。肝脏的内源性合成是TG的主要来源之一,肝脏胆固醇调节元件结合蛋白-1(sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1)和碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate responsive element-binding protein,ChREBP)是TG合成途径中的重要调控因子,二者激活可促进脂肪酸合成相关酶乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)的表达,调节机体TG合成[4-5]。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是调节脂质代谢的重要因子,SIRT1/腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)通路是TG合成的关键信号通路。SIRT1可激活AMPK,抑制SREBP-1与ChREBP表达[6],降低TG合成酶,减少肝脏TG合成。

高脂血症可归属于中医学“痰湿”“胸痹”等范畴[7]。瓜蒌薤白药对载于《金匮要略》治疗胸痹的瓜蒌薤白白酒汤、瓜蒌薤白半夏汤等方剂中,具有疏肝化痰、理气降浊的功效。前期研究[9]表明,瓜蒌薤白化痰降浊功效与其调节脂质水平密切相关,显著改善载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠肝脏代谢轮廓,减少肝脏TG蓄积。但瓜蒌薤白调节脂质水平的具体机制尚未明确,本研究旨在考察瓜蒌薤白对高脂血症小鼠肝脏TG合成酶、相关蛋白及SIRT1/AMPK通路的影响,从肝脏TG合成的角度阐明瓜蒌薤白调节脂质水平的作用机制,为瓜蒌薤白治疗脂质代谢疾病提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器超灵敏多功能成像仪(Amersham Imager 600):美国GE;多功能酶标仪(Multiskan Spectrum):德国赛默飞世尔科技公司;低温离心机(H1750R):湖南湘仪仪器开发有限公司;荧光定量PCR仪(MX3000P):美国安捷伦公司。

1.2 试剂阿托伐他汀钙分散片(200707):广东百科制药有限公司;瓜蒌(180601)、薤白(190201):合肥同仁堂大药房;TC(20210119)、TG(20210120)、LDL-C(20210119)、HDL-C(20210119)试剂盒:南京建成生物工程研究所;FAS(21010001)、ACC(21010003)试剂盒:上海江莱生物公司;RNA提取试剂盒(AC0202)、反转录试剂盒(AG0304-B)、荧光定量PCR试剂盒(AH0104-A):山东思科捷生物技术有限公司;SREBP-1抗体(bs-1402R):北京博奥森生物科技有限公司;ChREBP抗体(13256-1-AP):proteintech公司;SIRT1抗体(R25721):成都正能生物技术有限责任公司;AMPK抗体(PAB30970):武汉贝茵莱生物科技有限公司。

1.3 药物瓜蒌、薤白由安徽中医药大学韩荣春副教授鉴定,符合2015年版《中华人民共和国药典》标准。参考课题组前期研究[10],称取瓜蒌、薤白,按2∶1比例混合,充分粉碎,用50%乙醇(药材体积5倍量)充分浸泡1 h,80 ℃回流提取2次,每次2 h。过滤提取物,合并滤液,减压浓缩,制备含生药质量浓度为0.6 g/mL的瓜蒌薤白溶液。

1.4 实验动物 40只ApoE-/-雄性小鼠、8只C57BL/6J小鼠,两种小鼠均购自江苏省常州卡文斯实验动物有限公司[动物生产许可证号:SCXK(苏)2016-0010]。本实验获得安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准号:AHUCM-mouse-2020018)。

2 方法

2.1 动物分组与给药高脂饮食法复制小鼠高脂血症模型。40只8周龄ApoE-/-雄性小鼠用普通饲料适应性喂养1周,高脂饲料喂养20周,随机分为模型组,瓜蒌薤白低、中、高剂量组,阿托伐他汀组,每组8只;另设8只C57BL/6J小鼠为空白组。

空白组与模型组小鼠灌胃生理盐水,根据课题组前期研究[8-9],瓜蒌薤白低剂量(每日3 g/kg,相当于成人临床用量0.5倍)、中剂量(每日6 g/kg)、高剂量(每日12 g/kg)组小鼠分别给予相应剂量瓜蒌薤白提取液灌胃,阿托伐他汀组小鼠灌胃阿托伐他汀钙混悬液(每日10 mg/kg,相当于成人临床用量)。所有小鼠均在同一环境、同一时间内接受灌胃处理,于模型复制20周后给予相应药物4周。

2.2 酶法检测血脂变化末次给药后,各组小鼠禁食不禁水12 h,摘眼球取血,于4 ℃条件下,2 500 r/min离心20 min,取上清液。按试剂盒说明书检测TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

2.3 ELISA法检测肝脏FAS、ACC水平取小鼠肝脏,按肝脏质量(g)与生理盐水容积(mL)1∶9的比例加入生理盐水,研磨匀浆,于4 ℃条件下,3 000 r/min离心10 min,取上清液,按试剂盒说明书,于酶标仪450 nm波长处检测FAS、ACC水平。

2.4 qRT-PCR法检测肝脏FAS、ACC、SREBP-1、ChREBP、SIRT1、AMPK mRNA表达水平采用组织RNA快速提取试剂盒提取肝脏RNA,检测RNA浓度;取1 μg RNA反转录为cDNA,以cDNA为模板进行扩增,反应体系(10 μL)为cDNA模板1 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL,2×SYBR试剂5 μL,ROX Reference Dye Ⅰ 0.2 μL,不含RNA酶的H2O 3.4 μL。扩增条件为94 ℃预变性3 min;94 ℃变性20 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环;以GAPDH为内参,采用2-ΔΔCT法计算各mRNA的相对表达量。引物由上海生工生物有限公司提供,各引物序列见表1。

表1 引物序列

2.5 Western blot法检测SREBP-1、ChREBP、SIRT1、AMPK蛋白表达水平取肝脏适量,RIPA裂解液提取总蛋白,BCA法检测蛋白浓度,加入上样缓冲液,100 ℃煮沸10 min,-20 ℃储存。取适量蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳,200 mA湿法转膜,5%脱脂奶粉37 ℃封闭,TBST漂洗,加入一抗SREBP-1(1∶2 000)、ChERBP(1∶2 000)、SIRT1(1∶1 000)、AMPK(1∶1 000)4 ℃孵育;TBST漂洗,加入二抗(1∶10 000),室温孵育,TBST漂洗,ECL化学发光试剂显色,超灵敏多功能成像仪检测,采用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics)进行灰度分析。

3 结果

3.1 6组小鼠血脂水平比较与空白组比较,模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平显著升高(P<0.05),HDL-C水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,瓜蒌薤白低、中、高剂量组和阿托伐他汀组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平显著降低(P<0.05),HDL-C水平显著升高(P<0.05)。见图1。