电针“神门”穴对创伤后应激障碍小鼠行为学参数和前额叶皮质FKBP5表达的影响

钟 文,谢玉华,邢馨玉,王含笑,崔 帅

(1.安徽中医药大学研究生院,安徽 合肥 230012;2.安徽中医药大学针灸推拿学院,安徽 合肥 230012;3.经脉脏腑相关安徽省重点实验室,安徽 合肥 230012)

创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder,PTSD)是由异乎寻常的威胁性或灾难性心理创伤导致延迟出现和(或)长期持续的一种精神障碍[1]。流行病学研究[2]显示,全球一半以上的人口经历过创伤事件,PTSD的终生发病率和平均发病率分别为6.8%和8%。随着自然灾害、医学事件、暴力犯罪、情感虐待等创伤性事件的增多,PTSD的发病率正在逐年上升[3]。临床研究[4]表明,PTSD的严重程度与焦虑、抑郁状态和情绪失调等负面影响密切相关。针灸治疗作为情志疾病常用的临床治疗手段,对于改善PTSD以及焦虑、抑郁症状起到了较好的疗效,但其潜在机制仍不清楚[5-6]。

研究[7-8]表明,前额叶皮质(medical prefrontal cortex,mPFC)与PTSD的发病及焦虑、抑郁症状密切相关。FKBP5作为应激反应系统相关的基因,在mPFC中具有较高的表达水平,并能够调节糖皮质激素受体的敏感性,从而影响PTSD发病[9-10]。Ryu等[10]研究发现,FKBP5表达缺乏会导致mPFC对糖皮质激素受体激活不敏感,且FKBP5基因敲除小鼠对压力表现出弹性。同时,mPFC参与针刺治疗PTSD。Hou等[11]研究发现,针刺治疗PTSD是通过修复mPFC的病理变化来实现的。基于以上实验结果,笔者推测电针效应可能影响mPFC中FKBP5表达,以改善PTSD焦虑、抑郁样行为。因此,本研究以PTSD小鼠模型为研究对象,通过检测mPFC内FKPB5及其mRNA的表达,并观察小鼠在旷场和高架十字迷宫实验中行为学变化,从而揭示电针“神门”穴改善PTSD焦虑、抑郁症状的可能机制。

1 材料

1.1 实验动物与分组 雄性C57BL/6J小鼠(月龄2个月,体质量20～25 g)购自杭州子源实验动物科技有限公司[动物生产许可证号 SCXK(浙)2019-0004]。将4只小鼠饲养在同一笼具中,在温度(25±2)℃、相对湿度45%～65%的环境中进行12 h的光、暗循环饲养,小鼠自由摄食和饮水,适应性饲养7 d后,将小鼠随机分为正常组、模型组、电针组,每组6 只。本实验经安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准(证明号: 2022038)。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 小动物麻醉机(R500):深圳瑞沃德生命科技有限公司;一次性针灸针(0.16 mm×7 mm):吴江市云龙医疗器械有限公司;电针仪(SDZ-Ⅱ型):苏州医疗用品厂有限公司;化学发光仪(6300):天能;超微量分光光度计(OneDrop):五义科技股份有限公司;荧光定量PCR仪(7300):ABI;SuperMaze动物行为学分析软件、旷场箱(400 mm×400 mm×400 mm)、高架十字迷宫(50 mm×250 mm×50 mm):上海欣软信息科技有限公司。

1.2.2 主要试剂 异氟烷(R510-22):深圳瑞沃德生命科技有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒(89900):Thermo ScientificTM;qPCR SYBR Green试剂盒(11203ES03):翌圣生物;FKBP5(14155-1-AP):Proteintech;β-actin(R23613):CST;羊抗兔HRP标记二抗(L3012):SAB。

2 方法

2.1 模型复制 按照文献[12]方法复制PTSD小鼠模型。将小鼠放在限制管中固定2 h,随后立即在一个透明的丙烯酸圆柱形容器中强制游泳20 min,水温22～24 ℃,同时放置5～7只小鼠。将小鼠干燥并置入笼中15 min后,将其暴露于含5%异氟烷的密封容器中麻醉,直至其失去知觉(<1 min),重复3次。休息15 min后,小鼠在电击箱内接受单次电击(2 mA)2 s。最后,将小鼠放回笼中安静饲养,允许单一延长压力加电刺激(single prolonged stress and electrical stimulation,SPS&S)模型小鼠休息7 d。所有SPS&S模型复制程序均于下午2:00—5:00进行。

2.2 干预方法 模型复制7 d后,对电针组进行电针干预。电针组小鼠穴位定位参照《实验针灸学》[13],按照文献[14]方法取单侧“神门”穴,直刺2～3 mm,连续波,频率2 Hz,电流强度2 mA,电针15 min,每日1次,连续14 d。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 旷场实验 按照文献[15]的方法进行旷场实验。在实验开始时,将小鼠放置在一个立方体的中心,允许其自由移动5 min,采用SuperMaze动物行为学分析软件记录小鼠在中心区域的持续时间、活动距离、总距离。

2.3.2 高架十字迷宫实验 按照文献[15]的方法进行高架十字迷宫实验。该装置包括两个相对的张开臂,两个相对的闭合臂和一个中心区域,距离地面50 cm。在测试开始时,每只小鼠被放置在面对闭合手臂的中心区域,使用SuperMaze动物行为学分析软件跟踪其5 min内的运动,观察开臂时间和开臂次数,计算开臂时间比[开臂时间/(开臂时间+闭臂时间)×100%]和开臂次数比[开臂次数/(开臂次数+闭臂次数)×100%],作为焦虑状态的指标。

2.3.3 实时荧光定量PCR法检测前额叶组织FKBP5 mRNA表达水平 每组取3只小鼠mPFC,立即置于液氮中冷冻,然后转入-80 ℃冰箱内保存。首先用TRIzol提取组织中RNA,按照逆转录试剂盒步骤反向转录成cDNA。采用SYBR Green法进行实时荧光定量PCR反应,反应体系包括1×SYBR Green mixture 25 μL、上下游引物各1 μL、模板cDNA 2 μL、无RNA酶的水50 μL。反应条件:95 ℃ 5 min,1个循环;95 ℃ 10 s,55～60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,40个循环。以GAPDH为内参,采用2-ΔΔCT法分析FKBP5 mRNA的相对表达水平。FKBP5 mRNA的PCR引物序列见表1。

表1 引物序列及产物长度

2.3.4 Western blot法检测前额叶组织FKBP5表达水平 取出-80 ℃冻存的前额叶组织,加入500 μL裂解缓冲液,4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min,收集上清液,即为总蛋白溶液。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度,将蛋白溶液按照4∶1的比例加入5×还原型蛋白上样缓冲液,沸水浴变性15 min,置入-20 ℃冰箱保存。取出上述组织,依次加入上样缓冲液煮沸、上样、电泳、转膜、封闭;加入配置好的一抗(1∶1 000),4 ℃孵育摇床过夜,洗膜后加入二抗稀释液(1∶5 000),室温孵育30 min,再次洗膜后进行ECL化学发光检测,显影定影。采用化学发光成像系统(上海天能科技有限公司,型号Tanon-5200)和Image J(Wayne Rasband,lmage J 1.46r Java 1.6.0 20)分析胶片,以FKPB5与β-actin吸光度的比值作为FKPB5的相对表达量。

3 结果

3.1 3组小鼠旷场实验结果比较 与正常组比较,模型组小鼠中央区域停留时间、跨格次数、总移动距离显著减少(P<0.05);与模型组比较,电针组小鼠中央区域停留时间、跨格次数明显增加(P<0.05),总移动距离有增加趋势(P>0.05)。见图1。

图1 3组小鼠旷场实验结果比较

3.2 3组小鼠高架十字迷宫行为学参数比较 与正常组比较,模型组小鼠开臂时间、开臂次数明显减少(P<0.05),开臂时间比、开臂次数比显著降低(P<0.05);与模型组比较,电针组小鼠开臂时间、开臂次数明显增加(P<0.05),开臂时间比、开臂次数比显著升高(P<0.05)。见图2。

注:A.3组小鼠在高架十字迷宫中活动轨迹示意图;B.3组小鼠开臂时间比较;C.3组小鼠开臂次数比较;D.3组小鼠开臂时间比比较;E.3组小鼠开臂次数比比较;与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.3 3组小鼠mPFC中FKBP5及其mRNA表达水平比较 与正常组比较,模型组小鼠mPFC中FKBP5及其mRNA表达水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,电针组小鼠mPFC中FKBP5及其mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。见图3。

图3 3组小鼠mPFC中FKBP5蛋白及其mRNA表达水平比较

4 讨论

PTSD可归属于中医学“情志病”范畴,主要由于“脑神失养,气血阴阳失调”所致[16]。针灸调神具有独特优势。近年来,针灸因操作简便、价格低廉、无明显不良反应,已经成为治疗PTSD的常用方法之一[17]。“心者,君主之官”,《医学衷中参西录》提到“心脑息息相通,其神明自湛然长醒”,故PTSD可从心论治。心为五脏六腑之主,主血脉而藏神,七情致病,首伤心神,任何一种情志失调都会伤及心神。并且,外来之极惊扰乱心神而致心气虚是PTSD发生的首要病机[18]。故调心神即可调神、畅气血,改善心神失常、气机紊乱、气血失调所致的心神不宁、惊恐不安。神门为心经原穴、心经气血输注之处,针刺治疗情志病常选取该穴。《灵枢·九针十二原》载:“五脏有疾也,当取之十二原。”针刺原穴能使周身气机通达,从而发挥调畅气机的功效。因此,本研究选取神门穴以通调气血,醒脑开窍,神调则气血和、情志畅。

现代医学认为,PTSD发病机制复杂,主要与下丘脑—垂体—肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPAA)功能失调、神经递质系统功能障碍、谷氨酸系统失衡以及其他相关基因和蛋白表达异常有关[19]。研究[20]发现,糖皮质激素受体FKBP5的基因变异与PTSD发病机制密切相关。FKBP5基因多态性强烈预示中国人PTSD的进一步发展,并且其相关的miRNA的表观遗传调控可能会增加PTSD的患病风险[21]。作为与应激反应相关的HPAA,在PTSD发病中起重要作用[22],FKBP5基因能够通过调控糖皮质激素受体活性来调节压力应激所致的HPAA紊乱,改善不良应激反应[23]。有研究表明,针灸能够通过调节HPAA的功能[24],发挥抗焦虑、抗抑郁的作用,以达到治疗PTSD的目的[25]。本实验研究发现,电针“神门”穴能够有效下调FKBP5及其mRNA表达水平,并改善PTSD小鼠的焦虑样行为,提示电针改善PTSD焦虑抑郁样行为可能是通过影响基因FKBP5表达、调节HPAA实现的。

本实验研究证实,SPS&S可诱导小鼠产生焦虑样行为,并引起mPFC应激相关基因FKBP5表达水平降低。在旷场行为学实验中,水平运动总距离反映小鼠的运动情况,模型组小鼠水平运动距离明显减少,提示模型小鼠处于一定的抑郁状态。既往研究[10]报道,恐惧条件反射能够增加FKPB5在mPFC中表达水平,而抑制mPFC的边缘下皮质中FKBP5基因表达可以阻断恐惧条件反射后的冻结反应。本研究发现,电针能够下调FKBP5的表达水平并改善PTSD小鼠焦虑样行为,提示电针抗PTSD的效应可能是通过调节小鼠mPFC中基因FKBP5实现的。本研究仅针对前额叶中糖皮质激素基因FKBP5进行研究,FKBP5是否参与针刺治疗PTSD的相关信号通路,仍需深入研究。