基于网络药理学探讨四妙丸治疗腰椎间盘突出症的作用机制

朱智涛,陈 锋,袁 宁,陈祖鹏

(1.广西中医药大学,广西 南宁 530001;2.广西中医药大学附属瑞康医院,广西 南宁 530011)

腰椎间盘突出症(LDH)是常见的脊柱疾病之一,其因主要是腰椎的退行性病变,椎间盘纤维环破裂,椎间盘的正常结构遭到破坏,其中的髓核突出,从而压迫脊髓及神经根,出现腰腿痛、下肢放射痛等症状的腰部综合征[1-2]。根据流行病学调查,LDH发病率较高,约占人口的1.00%,多见于20～40岁中青年人群,好发于L4～L5及L5～S1椎间[3-4]。随着智能信息化的渗透,久坐的工作方式较为常见,LDH发病率也因此逐年升高,患病人群的生活质量受到了严重影响,也增加了家庭和社会的经济负担[5]。使用中药方剂治疗LDH的方法繁多,目前主要有四妙丸、左归丸、右归丸、身痛逐瘀汤、甘姜苓术汤、独活寄生汤等方剂。牛膝、苍术、薏苡仁、黄柏组成四妙丸,是清湿热、舒经络名方之一。目前尚无应用网络药理学方法来研究四妙丸对治疗LDH作用机制,因此,本研究目的在于分析四妙丸的药理作用,为临床上使用四妙丸治疗LDH提供可靠依据。

1 资料与方法

1.1文章中运用的数据库和软件工具:见表1。本研究经过本院医学伦理委员会同意。

表1 文章中运用的数据库和软件工具

1.2分析四妙丸的化合物及作用靶点蛋白:使用TCMSP选取出四妙丸药物的化合物成分,收录标准为:口服利用度(OB%≥30%)、类药性(DL≥0.18);再参考相关文献及《中华人民共和国药典》,对虽然不符合筛选标准但有明确生物活性及药理作用报道的化合物也纳入候选化合物。筛选出来的化合物在DrugBank数据库进行靶点收集,并通过Uniprot数据库进行简称注释。

1.3选取LDH的疾病靶点:从OMIM数据库、GeneCards数据库、Drugbank数据库中检索出关键词“Lumbar disc herniation”,收集LDH发病机制靶点。

1.4四妙丸和LDH的交集靶点的确定:将LDH疾病发病靶点和四妙丸标准化处理后的预测靶点通过R软件导入Venny作图平台,通过映射疾病-四妙丸靶点来构建韦恩图。映射出交集靶点可能为四妙丸治疗LDH的作用靶点。

1.5四妙丸治疗LDH主要活性化合物筛选:分别整理四妙丸药物的活性化合物与作用靶点的相互作用关系,应用Cytoscape软件构建四妙丸治疗LDH的“活性化合物-作用靶点”网络并进行相关分析,并选取出关键活性化合物。

1.6构建蛋白互作网络图及核心靶点筛选:将1.4中获得的作用靶点导入String线上分析平台进行蛋白互作网络分析,参数的设置保持默认,构建出作用靶点互作网络。再利用CytoHubba插件,筛选出四妙丸治疗LDH的核心靶点。

1.7四妙丸治疗LDH作用靶点功能及信号通路分析:利用R软件对筛选出交集靶点进行基因本体(GO)富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,得出生物过程、分子功能、细胞组成、通路信息。

2 结果

2.1四妙丸的方药组成及其药性分类:对四妙丸的4味中药进行药性分析,在归经分类上,多行于肾经、肝经、脾经。功效上多属化湿药。性味分类上,多属于苦味、甘味。见表2。

表2 四妙丸组成药物的药性分类

2.2四妙丸的化学成分及靶点预测:结合TCMSP筛选后,可得到四妙丸活性药物成分75种,其中黄柏37种、牛膝20种、苍术9种、薏苡仁9种。经DrugBank数据库匹配后,可得到四妙丸2 902个预测靶点, 分别为苍术276个,黄柏1 346个,牛膝1 034个,薏苡仁246个。

2.3LDH疾病靶点以及与四妙丸交集靶点的确定:分别在GeneCards、OMIM及Drugbank数据库中收集到疾病靶点380个、31个及9个,综合数据去重剔除后,得出LDH的相关发病机制靶点共399个。见图1。并得出四妙丸与LDH的交集靶点,共45个。见图2。

图1 LDH疾病靶点的韦恩图

图2 四妙丸与LDH靶点的韦恩图

2.4四妙丸治疗LDH主要活性成分筛选结果:四妙丸治疗LDH的“活性化合物-交集靶点”网络显示。见图3。其中有48种化合物成分没有找到对应疾病靶点,故未参与分析,得到27种有效化合物成分。共四妙丸4种组成药物的27个活性成分通过调控45个靶点治疗LDH,度值排名前2的活性化合物,即关键活性化合物为槲皮素(quercetin)、汉黄芩素(wogonin)。

注: :牛膝的化合物成分; :苍术的化合物成分; :薏苡仁的化合物成分; :黄柏的化合物成分; :“药物-疾病”的交集靶点;如圆形内有多种颜色,表示此化合物成分存在于多种中药中,具体见相关颜色。

2.5共同靶点蛋白互作(PPI)网络构建及分析:对交集靶点构建蛋白互作网络(PPI)网络。见图4。使用Cytoscape的插件CytoHubba筛选出6个作为核心靶点,分别为促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)14、MAPK1、白细胞介素(IL)-6、雌激素受体(ESR)1、FOS核蛋白转录因子和JUN原癌基因。见图5。

图4 LDH与四妙丸交集靶点的互作网络图

图5 四妙丸治疗LDH的核心靶点

2.6交集靶点的GO富集分析及KEGG分析:交集靶点GO富集分析得到GO条目2 004个。其中生物过程1 881个,细胞组成 25个,分子功能98个。富集程度前10见图6。交集靶点KEGG富集分析得到137条信号通路,富集程度最高的前20条信号通路见图7。

图6 四妙丸治疗LDH交集靶点富集的GO分析结果图

图7 四妙丸治疗LDH交集靶点富集的KEGG通路气泡图

3 讨论

LDH引起的腰腿痛和下肢放射性麻木疼痛是促使患者就诊的重要原因,有学者认为当脊髓神经根受到压迫时,主要表现不是疼痛而是麻木,而炎性反应是腰腿痛的主要原因。中医方面,LDH归于“腰痛病”“痹证”的范畴,病机多为“经脉闭阻,腰府失养”,而四妙丸源自《成方便读》,有清湿热、利湿浊、通经活络的功效,是治疗腰痛病、痹症等疾病的经典方剂之一。四妙丸由黄柏、薏苡仁、苍术、牛膝组成,该方药方组成较少,但其药力专一、药性平稳、组方精炼。现代药理研究表明该方具有抗炎抑菌、调节免疫、解热镇静、镇痛等多种药理作用[6]。

研究得出四妙丸治疗LDH的关键化合物是槲皮素、汉黄芩素。槲皮素研究表明槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗病毒作用[7-8]。孙军等[9]发现槲皮素对氧化应激损伤有着改善作用。有研究表明汉黄芩素能抗炎是因减少前列腺素E2的表达[10-11]。有前期研究表明汉黄芩素能通过下调肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平达到抑制炎性反应作用[12],而TNF-α与炎性反应关系紧密。因此,四妙丸中关键活性化合物的抗炎镇痛、抗氧化应激的作用可能在治疗LDH发挥了重要作用。

PPI网络结果显示,四妙丸治疗LDH的核心靶点为MAPK14、MAPK1、IL6、ESR1、FOS和JUN。MAPK14作为MAPK家族中的成员之一,其表达异常与炎性反应密切相关。当机体受到炎性因子、紫外线照射等刺激后,p38MAPK通路得到激活,炎性级联反应也随之启动[13]。IL-6作为机体重要的调节因子,分泌到血清中,并通过IL-6受体α诱导转录炎性反应。有研究发现ESR1基因的表达可能会增加膝骨关节炎的患病风险[14]。FOS是神经功能活动的代谢性标志物,参与感觉形成的信息传递、调控和整合[15]。另有实验证实,FOS的阳性表达与伤害性刺激信号的传入密切相关[16]。JUN存在于神经细胞中,参与疼痛信息的传递过程,能对神经传递物质、神经冲动、激素和外部刺激等信息做出反应,进行特异性表达的特点[17]。可见,四妙丸可能在抑制炎性反应、阻碍伤害性刺激信号的传导等过程中发挥重要作用,具有抗炎、抑制神经功能活动的作用。其具体作用机制还需进一步研究。

GO富集分析结果提示,其生物过程体现在对细菌源性分子的反应、对氧化应激的反应等。以上反映在LDH发病过程中较为常见。KEGG富集的通路分析发现涉及多条信号通路,主要包括AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等。AGE-RAGE通路能激活NF-KB,进而刺激促氧化靶基因的表达,加速炎性反应因子的分泌,而大量的炎性细胞因子的表达能触发相对应的炎性反应,造成持续性细胞损伤及功能紊乱[18]。TNF称为肿瘤坏死因子,是引起椎间盘退变的主要炎性反应物质之一[19]。IL-17是作为近年来发现的一组促炎因子之一,参与体内的炎性反应[20]。可见四妙丸可能在抗炎、抑制氧化应激反应等途径上有效地治疗LDH,且与目前已知研究结果一致。

综上所述,四妙丸治疗LDH是可能是通过调控MAPK14、MAPK1、IL6、ESR1和FOS的产生,抑制炎性反应、抗氧化应激反应、阻碍伤害性刺激信号的传入来实现的,该治疗过程中槲皮素及汉黄芩素的消炎镇痛及修复氧化应激损伤的功能可能其中发挥了重要的作用。文章分析出多个药物有效成分、多个治疗靶点及多条信号通路,这也体现出中药复方多成分-多靶点-多通路治疗疾病的特点,为中医药临床治疗LDH及进一步研究其相关机制提供了参考。

网络药理学的兴起是“中医药传承创新发展”的体现,开辟了中医药研究的新思路与方法。中医药的经验诊疗与循证医学的有机结合是网络药理学的表现形式,也是一种新型研究方式。同时,作为一门仍处于初期阶段的新兴学科,仍存在很多不足与局限性:①受各种平台数据库、相关软件算法的限制,有小部分药物有效化合物未能找到相对应的靶点,也没有明确配伍后药物有效成分是否会发生药代动力学等性质的改变,如是否能将单味中药活性成分叠加作为复方活性成分,而中药在煎制过程中是否有药性变化。②中药活性成分确定筛选标准是口服生物利用度、类药性,但却忽视了中药活性成分存在着口服生物利用度低的问题。如人参中的人参皂苷类,口服生物利用度低,但是人参作为拯危救脱、补肺脾气要药,在中医药治疗疾病中有着举足轻重作用,以口服生物利用度作为标准排除人参皂苷类显然不合理。③需进一步完善和验证基因组代谢途径,以空间关联为基础将药物化合物、靶点、病理-生理过程、疾病进行进一步研究。④需要用动物试验、临床试验等来验证研究的合理性、降低同质化与偏倚性。网络药理学是符合中医药的发展原则,随着研究的不断深入以及分析手段的更新,现代化技术与中医药能更好地有机结合。至此本研究有以下3点建议:①网络药理学涉及药理学、临床医学、病理学、人工智能、生物信息学等多种学科,虽然涉及领域广,但同时单一领域的研究有所不足,需有所侧重。②中药制剂需要与新型制作工艺相结合,如固体分散技术、纳米技术、自微乳化释药系统、磷脂复合技术等,以达到物尽其效。③目前一些新兴起研究方法例如单细胞组学、空间组学尚未与中医药系统药理学进行交会,需突破技术屏障,结合新型研究方法,在原有的研究方法上推陈出新,同时这也需要多学科研究者共同努力。