子痫前期患者外周血潜在标志物筛选及其诊断价值

冯 艳

(天津市静海区医院产科,天津 301600)

临床流行病学研究显示,子痫前期(PE)发病率在所有妊娠中约3%～14%[1]。然而,PE发病确切的分子机制仍未完全阐明,大多数研究认为其可能与孕妇体内炎性因子导致的胎盘血管阻力增高有关[2],其发病机制包括血管痉挛、血管内皮细胞激活、血管舒张因子减少等有关[3]。子痫前期是一种妊娠相关疾病,其特征是高血压和大量蛋白尿,其发病大多在妊娠20周后开始,与产妇的死亡率、器官功能障碍或胎儿生长受限密切相关[4]。据估计,PE的发病率占所有孕妇的3%～10%,其发生可能与肥胖、高血压、高龄、妊娠期糖尿病等危险因素有关[5-6],其分子机制可能与氧化应激、免疫不耐受和血管生成失衡密切相关。PE应进行早期识别和干预,因此探寻发现新的PE诊断生物学标志物具有重要临床意义。近年来,借助基因芯片和RNA测序技术,以及GEO等公共基因表达数据库,众多的疾病诊断、预后分子被鉴定和应用于临床。然而,关于PE表达谱及诊断的研究报道较少,因此本研究采用生物信息分析筛选PE差异表达基因并评价其诊断PE的临床价值。

1 资料与方法

1.1研究设计:该研究采用生物信息分析及验证设计。第一,在GEO数据库中检索和筛选子痫前期与正常孕妇差异表达基因比较的数据集;第二,对数据集中共差异表达基因进行筛选;第三,对共差异表达基因进行蛋白网络互作分析(PPI);第四,筛选出PPI网络中的hub(关键基因);第五,对关键基因作为子痫前期诊断标志物可能性进行分析。具体试验流程见图1。

1.2数据及资料:本研究所涉及和使用的数据库包括:①基因综合表达数据库(GEO,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/);②京都基因与基因组百科全书(KEGG,https://www.kegg.jp/kegg/);③蛋白互相作用拓扑网络数据库(STRING,http://string-db.org/cgi/input.pl)。

1.3数据检索及分析:首先在GEO数据库中检索子痫前期对比正常孕妇差异表达的基因数据集,检索词为“preeclampsia”,种属为“homo”。对初步检索到的数据集进行摘要阅读,选取了GSE10588、GSE48424和GSE60438 3个数据为研究对象,对3个数据集中差异表达的基因进行筛选,筛选条件为基因拷贝数相差2个,且P<0.05;然后对3个数据集中各自的差异表达基因进行共差异分析,并绘制Venn图。随后在STRING数据库中鉴定出来的子痫前期与正常孕妇共差异表达基因进行蛋白相互作用拓扑网络构建,构建条件为:数据来源Textmining,co-expression,gene function 和co-occurrence;相互作用关系系数≥0.4;相互作用蛋白不高于40个。在KEGG数据库中对筛选出的差异表达基因相关信号通路进行分析富集,采用Cytoscapev 3.7.2软件对拓扑网络中的hub基因进行筛选关键hub基因,筛选依据为node-score。

2 结果

2.1子痫前期患者与健康孕妇差异表达基因筛选:GSE10588、GSE48424和GSE60438 3个数据为研究对象,3个数据集基本特征见表1。3个数据集中共差异表达的基因为7个(图2),分别为TLR4、MYD88、PRKAR1A、GCH1、NF-κB、FN1UBOX5、ZC2HC1A。

表1 纳入分析的3个数据基本特征

注:A: GSE10588数据集;B:GSE48424数据集;C: GSE60438 数据集;D:3个数据集Venn图

2.2子痫前期患者与健康孕妇差异表达基因GO及KEGG富集:7个差异表达基因GO分析主要富集于模式识别受体信号通路、I-kappaB / NF-kappaB复合体、toll样受体结合等(表2)。KEGG信号通路主要富集于NF-kappa B信号通路、toll样受体信号通路、MAPK信号通路等。

表2 差异表达基因GO富集

2.3PPI拓扑网络及hub基因:7个子痫前期患者与健康孕妇差异表达基因绘制PPI拓扑网络,网络中有42个蛋白节点,69个作用关系,平均作用度为8.05,区域聚类指数为0.754,图3A。Cytoscapev3.7.2软件对拓扑网络中的hub基因进行筛选,TLR4和MYD88为差异基因中的关键hub基因,图3B。

PPI拓扑网络 hub基因鉴定网络

2.4血清Hub基因诊断子痫前期价值:TLR4基因和MYD88基因在子痫前期患者血清中的相对表达水平明显高于正常孕妇,差异有统计学意义(P<0.05)。血清TLR4为参考诊断子痫前期的敏感性为83.33%(95%CI:58.58%～96.42%),特异性为72.22%(95%CI: 46.52%～90.31%),ROC曲线下面积AUC为0.87; 以MYD88为参考诊断子痫前期的敏感性为77.78%(95%CI: 52.36%～93.59%),特异性为71.34%(95%CI:42.11%～87.83%),ROC曲线下面积AUC为0.80。见图4。

注:A: TLR4基因在子痫前期与正常孕妇中的表达比较;B: TLR4基因诊断子痫前期的ROC曲线;D: MYD88基因诊断子痫前期的ROC曲线;C: MYD88基因在子痫前期与正常孕妇中的表达比较

3 讨论

子痫前期(PE)是妊娠期常见的高血压疾病,流行病数据显示,全球发病率约为2%～5%。约14%的孕产妇死亡是由PE引起的,PE已成为孕产妇和围产期死亡率上升的主要原因[7-8]。与血压正常的孕妇相比,有妊娠高血压史或PE的孕妇后期发生肾脏、心血管疾病甚至认知功能受损的风险明显增加。此外,PE可加重胎儿宫内缺氧,导致早产,胎儿生长迟缓,或胎儿心脏发育缺陷导致胎儿心脏功能障碍。然而,PE的病因较多,与多种因素包括高龄、高血压史、糖尿病等有关,同时近年来的研究显示,PE的发生与遗传因素有关[9],基因差异表达在PE的发生发展中发挥了重要作用。一般情况下,PE的发展可分为无症状和有症状两个阶段,妊娠早期胎盘发育异常引起胎盘功能障碍,后期导致炎性因子释放到母体血液中,导致高血压和器官损害。PE早期诊断并进行干预患者往往预后较好,因此探寻发现新的PE诊断生物学标志物具有重要临床意义。近年来,采用GEO等公共基因表达数据库进行相关疾病诊断、预后分子被鉴定和应用于临床。TLR4在胎盘组织中表达水平明显升高,而在正常妊娠孕妇中期阳性表达率较低[10],说明TLR4在PET发生发展中可能发挥了重要作用,与本研究一致。同时本研究还进一步评价了血清中TLR4的表达情况,认为PE患者血清中TLR4也明显高于正常孕妇并具有较高的诊断价值。MYD88同样为Toll样受体相关信号通路中的重要分子,在免疫应答和炎症反应中发挥重要作用[11],其在PE患者血清中的高表达可能参与了PE的发生与发展,并可作为其诊断的血清学标志物且具有较高的诊断敏感性和特异性。