甲状腺功能亢进性心脏病患者调节性T细胞与细胞因子水平的相关性

聂子凡,李 波

(1.滨洲医学院,山东 滨州 256603;2.滨洲医学院附属淄博市中心医院心内科,山东 淄博 255036)

调节性T细胞(Treg)的概念首先是由Gershon等在1971年提出来的,近年来越来越多的证据表明CD4+CD25+Treg细胞在外周免疫耐受的维持中发挥着主要的作用,现已发现人类外周血CD4+CD25+Treg细胞与多种自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎及多发性硬化症等关系密切[1-3]。甲状腺功能亢进性心脏病(HHD)是与自身免疫性甲状腺疾病相关的心脏疾病[4],但目前关于Treg细胞与人类自身免疫性甲状腺疾病之间关系或相关性的研究还比较少,关于HHD中Treg细胞的研究更少见。本研究旨在探讨HHD患者中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量、细胞因子水平的变化与HHD相关病变指标的相关性,探索CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞改变与自身反应性T细胞的活动状态,从而有助于了解HHD患者Treg细胞变化在自身免疫性病变进程中的作用和可能的机制。

1 资料与方法

1.1研究对象与分组

1.1.1HHD组:选择2021年1月～2022年10月在淄博市中心医院心内科、普外科和胸外科住院的HHD患者。诊断标准:临床症状、体征、彩超、血清甲状腺自身抗体及细针穿刺,并依据文献[4]。纳入标准:临床诊断为HHD,同意参加并配合研究者。排除标准:近两个月使用过糖皮质激素和(或)免疫抑制类药物。符合标准的HHD患者共38例,均为女性,年龄25～49岁,平均(39.7±8.5)岁。常规病理均诊断为甲状腺功能亢进。术前1～3 d各抽取空腹静脉血10 ml,置抗凝肝素管,冰浴运输。

1.1.2正常对照组:选择健康志愿者20例,均为女性,年龄24～53岁,平均(38.9±10.2)岁,抽取空腹静脉血10 ml,置抗凝肝素管,冰浴运输。

1.1.3HHD组:收集2021年10月～2022年8月淄博市中心医院外科手术切除的HHD甲状腺组织及HHD甲状腺石蜡包埋组织块。诊断标准:临床症状、体征、彩超、血清甲状腺自身抗体及细针穿刺,并依据文献[4]。纳入标准:临床诊断为HHD且甲状腺细针穿刺建议做活检,而快速病理诊断为甲状腺功能亢进,并伴有心律失常、心脏增大和心力衰竭。并且未使用过糖皮质激素和免疫抑制类药物。排除标准:使用过糖皮质激素和免疫抑制类药物。符合标准的HHD甲状腺石蜡包埋组织共20例,均为女性。年龄21～53岁,平均(41.2±9.9)岁。

1.1.4正常对照组:正常甲状腺15份为距甲状腺囊肿或距甲状腺瘤1 cm以外的甲状腺组织及甲状旁腺切除术所切除的小块甲状腺组织。其中临床诊断甲状腺囊肿4份,甲状腺瘤6份,甲状旁腺切除术5份。正常对照组均为女性,年龄23～54岁,平均(42.1±10.7)岁。经独立样本t检验,HHD甲状腺石蜡包埋组与正常对照组年龄比较,差异无统计学意义(t=0.514,P>0.05),HHD甲状腺组与正常对照组年龄差异无统计学意义(t=0.612,P>0.05)。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2方法:采用免疫组化染色方法和流式细胞技术检测HHD患者和正常人甲状腺组织中CD25和Foxp3分子的阳性表达及分布情况。通过流式细胞技术检测正常对照和HHD患者术前外周血中CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量变化;通过电化学发光技术分析HHD血清中甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)和甲状腺球蛋白抗体(TGAb)水平;分析Treg细胞数量变化与甲状腺自身抗体和甲状腺细胞病理改变的相关性;通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测外周血白细胞介素(IL)-6、IL-2、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-4、转化生长因子-β(TGF-β)及IL-10水平并同时分析它们与Treg细胞的相关性。

2 结果

2.1HHD患者甲状腺组织病理变化及血清抗体改变的主要特征:HHD患者彩超结果显示甲状腺呈现弥漫性肿大,峡部锥体叶肿大,被膜粗厚,内部回声呈网状CDFI血流信号丰富,与正常对照组血清TGAb(26.4±12.1)IU/ml比较,HHD组血清TGAb(325.5±78.2)IU/ml、TPOAb(140.1±63.7)IU/ml明显增高。病理学分析可见,HHD甲状腺呈现弥漫性肿大,峡部锥体叶肿大,腺体质地较韧,组织学分析时可见切面呈分叶状,色灰白灰黄,有时变黑。显微镜下观察发现,甲状腺实质组织广泛破坏,萎缩,较多淋巴细胞浸润,淋巴滤泡形成,纤维组织增生,有时可出现多核巨细胞。甲状腺组织内的炎细胞浸润指数显著提高(表1)。而正常对照组甲状腺组织的甲状腺滤泡发育成熟,滤泡腔充满胶质,分布均匀,滤泡呈小叶状排列,小叶周围有少量纤维组织和血管,未见炎细胞浸润。

表1 HHD甲状腺组织内的炎细胞浸润指数(n)

2.2HHD外周血Treg细胞的变化及与细胞因子水平、自身抗体、病理改变的相关性:HHD患者外周血Treg细胞的比例(0.81±0.26)%,明显低于正常对照组的(2.50±0.69)%,差异有统计学意义(P<0.05),而CD4+CD25+T细胞的比例明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)(见图1、图2)。HHD患者外周血IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平与正常对照组比较明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),IL-4、TGF-β及IL-10与正常对照组比较明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)(见表3)。Treg频数与甲状腺组织的炎性反应程度呈负相关(r=-0.511,P<0.05),与TGAb、 TPOAb呈负相关(r=-0.477、-0.485,P<0.05)。与IL-4无显著相关性(r=0.317,P>0.05),但与IL-10、TGF-β水平正相关(r=0.714、0.525,P<0.05),与IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平呈负相关(r=-0.536、-0.673、-0.512、-0.498,P<0.05)。

图2 两组外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg流式检测

表3 HHD患者外周血IL-6、IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、TGF-β及IL-10测定结果

2.3HHD患者甲状腺组织中Foxp3+、CD25+、Treg细胞表达水平及与细胞因子水平、自身抗体、病理改变的相关性:Foxp3+细胞在正常甲状腺主要分布于甲状腺滤泡附近,在HHD甲状腺主要分布在淋巴滤泡的浸润淋巴细胞上,与正常对照组比较数量显著下降 (P<0.05)(见表4、图3)。CD25+细胞在正常甲状腺主要分布于甲状腺滤泡附近,在HHD甲状腺主要分布在淋巴滤泡的浸润淋巴细胞上,在甲状腺细胞密集的区域,CD25也有不同程度的表达。HHD甲状腺CD25阳性表达明显高于正常甲状腺(P<0.05)(见表4、图3)。与CG组甲状腺Treg细胞比例(3.52±0.78)%比较,HHD甲状腺Treg细胞比例(1.21±0.79)%明显减低(P<0.05),而CD4+CD25+T细胞比例明显增高(P<0.05)(见图4、图5)。HHD甲状腺Treg的频数与甲状腺组织的炎性反应程度呈负相关(r=-0.478,P<0.01)。HHD甲状腺中Treg的频数与TGAb、TPOAb呈负相关(r=-0.497,-0.489,P<0.05)。HHD甲状腺Treg与外周血IL-4无显著相关性(r=0.297,P>0.05),与血中IL-10、TGF-β水平呈正相关(r=0.682、0.517,P<0.05)。与血中IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平呈负相关(r=-0.476、-0.652、-0.523、-0.491,P<0.05)。

图3 两组甲状腺组织中Foxp3和CD25的表达(DAB,×400)

图4 两组甲状腺组织CD4+CD25+Treg流式检测

图5 两组甲状腺CD4+CD25+Foxp3+Treg流式检测

表4 HHD组甲状腺组织中CD25和Foxp3的表达(n)

3 讨论

调节性T细胞是一组具有免疫抑制功能的T细胞亚群,CD4+CD25+Treg细胞是调节性T细胞家族中最主要的亚群,其具有免疫无能和免疫抑制作用[5]。其特征性的分子标记是Foxp3。Foxp3被认为是促进CD4+CD25+T细胞分化成熟以及维持其功能的主要调控子。动物实验发现小鼠自身免疫性疾病的发生与CD4+CD25+Treg细胞有密切的关系,其体内Treg细胞的缺乏可导致自身免疫性胃炎、肠炎和I型糖尿病等多种自身免疫性疾病产生,而外源性补充CD4+CD25+Treg细胞则可逆转自身免疫性疾病的病理进程[6]。HHD是一种自身免疫性疾病,本病为自身免疫病的佐证如下:本病患者外周血及组织中辅助T细胞及其细胞因子异常,血清中抗甲状腺抗体包括TGAb与TPOAb常明显升高。本研究提示HHD甲状腺内大量活化的效应性T细胞的存在可能是其CD4+CD25+T细胞数量增加的原因,HHD甲状腺内Foxp3+Treg细胞数量的下降则是导致其对自身反应性T细胞调节失控的主要原因。Foxp3+Treg细胞数量的下降与甲状腺中的免疫失衡有着密切的关系。

自身免疫性甲状腺疾病患者存在CD4+CD25+调节性T细胞数目和功能异常[7]。黄广英等[8]研究发现,自身免疫性甲状腺疾病患者甲状腺内CD4+CD25+调节性T细胞数目减少,Foxp3+CD4+CD25+细胞比例减少更为明显,而活化CD4+细胞数目增加,提示自身免疫性甲状腺疾病患者由于甲状腺内调节性T细胞数目减少,调节性T细胞的免疫调节功能被抑制,自身反应性T细胞活化。该研究还发现自身免疫性甲状腺疾病患者甲状腺内CD4+CD25+调节性T细胞中凋亡细胞的比例比CD4+CD25-细胞中凋亡细胞比例明显增多,提示患者甲状腺内的CD4+CD25+调节性T细胞对凋亡的易感性增加,进入凋亡过程,使得甲状腺内CD4+CD25+调节性T细胞数目减少,导致调节性T细胞与自身反应性T细胞活性不匹配,引发自身免疫性甲状腺疾病。本研究利用透膜技术在CD4和CD25标记的基础上把Foxp3作为标记,能更好地反映Treg细胞的真实水平,研究发现:HHD组甲状腺与CG组甲状腺比较,CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例明显减低;HHD患者外周血CD4+CD25+Foxp3+的比例明显也低于正常对照组;并且HHD甲状腺和外周血Treg的频数与甲状腺组织的炎性反应程度呈负相关。说明HHD患者体内存在免疫反应紊乱,Treg细胞参与了HHD甲状腺病理进程。

对于甲状腺功能亢进患者的细胞因子的研究可见少量报道[9]。本课题发现HHD组患者外周血IL-2、IL-6的水平与正常对照组相比明显升高,IL-4与CG组相比明显降低;HHD患者外周血中IL-10、TGF-β的含量也降低,同时Treg细胞占CD4+T细胞的比例与IL-10、TGF-β的含量呈正相关。Treg细胞活化后主要通过细胞接触依赖机制或抑制性细胞因子依赖机制主动发挥免疫抑制作用,其可分泌大量的IL-10、TGF-β等抑制性细胞因子,用相应抗体中和此类细胞因子则其体内免疫抑制作用降低,说明Treg细胞的功能可以通过这些抑制性细胞因子来实现[10]。这些细胞因子具有抑制抗原呈递细胞及拮抗效应性T细胞的功能,在Treg细胞介导的免疫耐受及Treg细胞的产生和增殖中发挥着重要作用[11-12]。因此本研究推测可能由于HHD患者外周血中Treg细胞数量的减少,能够发挥有效免疫抑制作用的细胞数减少,导致自身反应性T细胞激活增多,凋亡减少。同时Treg细胞减少,产生抑制性细胞因子的含量降低,抑制能力下降,导致激活的自身反应性T淋巴细胞增多。本研究结果表明,HHD患者血清TNF-α水平显著高于CG组,其升高原因初步分析为:由于患者存在自身免疫功能缺陷,特别是组织免疫受到抑制,过量的TNF-α刺激单核一巨噬细胞的结果,是否还有其他因素影响,尚待进一步探讨。本课题还发现,HHD患者血清IFN-γ水平也显著高于CG组,并与外周血和甲状腺Treg相关,表明TNF-α、IFN-γ与HHD的细胞免疫下降有关,TNF-α、IFN-γ共同参与了HHD的发病,可以作为HHD免疫状态的检测指标。

为进一步证实Th1、Th2细胞因子的水平以及研究HHD患者体内Th1、Th2与Treg之间的关系,本研究分析了CD4+CD25+Foxp3+Treg与细胞因子之间的相关性。发现HHD患者外周血IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平与CG组比较明显升高。IL-4、TGF-β及IL-10与CG组比较明显降低。HHD患者外周血Treg与IL-4无显著相关性(P>0.05)。HHD患者甲状腺和外周血Treg与血中IL-10、TGF-β水平呈正相关,与血中IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平呈负相关。推测患者体内降低的CD4+CD25+Foxp3+Treg不能抑制体内的自身免疫反应,促进了Th1类细胞因子分泌,另一反面Th1类细胞因子抑制体内效应性T细胞过度增值和活化。本研究进一步发现,HHD甲状腺和外周血Treg的频数与甲状腺组织的炎性反应程度呈负相关。说明Treg参与了HHD病理进程,与HHD发病明显相关。另外还有研究发现IL-1、IL-6、IL-12、IL-18等在体外可以明显下调Treg细胞的抑制作用[13]。因此外周血中Treg细胞对效应性T细胞抑制作用失控的原因还需进一步的研究。

HHD患者血清中TPOAb和TGAb均有不同程度的升高。甲状腺微粒体抗体是针对甲状腺微粒体的一种抗体,靶抗原为甲状腺过氧化物酶,TPO是一种与膜结合的血红素蛋白,是甲状腺激素合成的关键酶,也是引起自身免疫性甲状腺疾病的一个重要的自身抗原,其与TPO抗体(TPOAb)的免疫反应,会引起自身免疫性甲状腺疾病患者的临床症状的变化。甲状腺球蛋白(Tg)占全部甲状腺蛋白的75%,是由甲状腺滤泡细胞合成的一种糖蛋白,为甲状腺滤泡胶体及细胞内基质的主要成分。TGAb是自身免疫性甲状腺疾病患者血清中的一种常见自身抗体。本课题研究发现,HHD患者血清TGAb、TPOAb与CG组比较明显升高,为进一步证实TGAb、TPOAb的水平与Treg之间的关系,本研究分析了CD4+CD25+Foxp3+Treg与TGAb、TPOAb之间的相关性,发现HHD甲状腺Treg的频数与TGAb、 TPOAb呈负相关;HHD外周血Treg的频数与TGAb、 TPOAb呈负相关;这可能与HHD患者细胞免疫功能低下有关,而HHD患者体液免疫功能增强有关,B细胞活化产生大量的自身抗体,这可能是由于Treg细胞数量减少,不能正常抑制B细胞的功能。

综上所述,HHD 患者甲状腺Treg细胞的数量下降,活化的自身反应性T细胞大量增加,并因此造成甲状腺内免疫调节失控。HHD患者甲状腺和外周血CD4+CD25+Foxp3+T细胞明显减少,并且与细胞因子、甲状腺自身抗体及甲状腺病理相关,这群调节性T细胞可能通过细胞因子和甲状腺自身抗体参与了HHD的病理进程。