青蒿素研发的成功经验对结核病防治的借鉴与启示

曹玉清 尚希钰 熊一白 纪鑫毓 马艳

几千年来,由恶性疟原虫引起的疟疾一直是危及生命的疾病[1],也是严重危害人民健康和生命安全的重大传染病,世界卫生组织(WHO)把疟疾与艾滋病、结核病一起列为全球三大公共卫生问题[2-3]。全球有108个国家和地区都流行过疟疾,共有约33亿人受到威胁。2021年全球84个疟疾流行的国家和地区中,疟疾患者数达2.47亿例, 死亡患者数约为61.9万例[3]。第一次和第二次世界大战期间,殖民非洲、亚洲等地的部队也曾发生疟疾大流行[4]。在20世纪50年代国际上试图根除疟疾失败后,疾病发生反弹主要是由于疟原虫对抗疟药物氯喹等产生耐药性,迫切需要新的抗疟疾药物。我国青蒿素及其衍生物、复方研发的成功并广泛用于全球抗疟疾治疗,是中医药学惠及全人类的重大贡献之一。这些源于我国多部门及多领域的众多科学家为此项系统工程奋斗了几十年的成果,期间积累了大量的经验。目前,全球及我国结核病负担仍较重,是仅次于新型冠状病毒感染的第二大传染病杀手,也是全球第13大死因之一,而我国结核病负担居全球第3位[5],如期实现2035年终止结核病流行的目标仍存在较大的挑战[6-8]。笔者现就青蒿素研发背景、发现历程等内容进行系统的梳理,总结其成功经验,为制定我国结核病防治策略提供参考。

青蒿素的研发背景及发现历程

一、研发背景

在20世纪50年代,耐药寄生虫的大规模出现对疟疾的防疫和治疗形成了严峻挑战,以东南亚和撒哈拉以南的非洲地区尤为严重[9]。我国也很严峻,据相关研究报道,疟疾流行的县(市)高达1829个,约占当时县(市)总数的 70%～80%[4]。1965年,疟疾流行面积占全球总面积的36.65%,感染疟疾的人数约20亿,占全球人口的57.21%。因此,开发新型抗疟疾药物在当时迫在眉睫,全世界范围的科学家都在为寻求新型抗疟疾药物而努力。1964年,美国与越南战争爆发,在越南方面的请求下,同时也是为了解决中国南方地区的疟疾问题,毛泽东主席和周恩来总理指示:“把解决热带地区部队遭受疟疾侵害,严重影响部队战斗力,影响军事行动的问题,作为一项紧急援外、战备紧急任务立项”[10-12]。鉴于疟疾防治的迫切性与复杂性,为了援外、战备紧急任务的需要,国家科学技术委员会、中国人民解放军总后勤部于1967年5月23日召开了全国疟疾防治药物研究大协作会议,并提出开展全国疟疾防治药物研究的大协作工作(简称“523任务”),组织国家部委、军队直属及10个省、市、自治区和有关军区的医药科研、医疗、教学、生产等单位,针对热带地区抗药性恶性疟疾严重影响部队战斗力的问题,开展防治药物的研究。可以说“523任务”是中国现代医药研究的第一个“大科学”研究计划,此研究计划具有组织的科研合作、多机构的优势整合、投入人力资金强度大等特点[12-13]。从此我国拉开了抗疟疾新药研究的序幕[14-16]。

二、研发历程

(一)科学的组织管理模式

为了落实 “523任务”规划,加强领导,由国家科学技术委员会、国防科学技术工业委员会、中国人民解放军总后勤部、中华人民共和国卫生部、中华人民共和国化工部、中国科学院等6个部门组成了全国疟疾防治药物研究领导小组(即“全国523任务”领导小组),直接归国家科学技术委员会领导。全国“523任务”领导小组下设办事机构,以中国人民解放军后字236部队主导,中国科学院、中国医学科学院、中国医药工业公司各派1名人员组成。办公室设在后字236部队,负责研究规划、计划的落实和地区间、单位间、专业之间分工合作的组织协调工作。各部委所属,各省、市、区所属,军队所属单位,以驻地的北京、上海、广州(含海南)、南京、昆明和四川、广西等地区成立了地区“523任务”领导小组和办事机构[12]。根据战备任务及其指标要求,任务分5个专题研究进行;根据专业特点将参加单位分为药物合成与筛选协作组、中医中药协作组、驱蚊剂协作组和现场防治协作组(包括制剂小组)4个协作组,要求承担规划任务的各基层单位所在地区的省(市)科学技术委员会、军区、卫生厅(局)及各基层单位,要认真领导这项工作。科学技术人员要和工农兵结合、实验室和临床现场相结合,胜利完成这项紧急战备任务。另外,此项研究任务按照秘密级规定执行,全国及地区“523任务”办公室在整个疟疾防治药物的研究过程中起到十分重要的上传下达及统筹安排的作用。组织管理模式见图1。

注 A:疟疾防治药物研究工作协作领导小组;B: 4个专业组;C:3年规划的5个专题;D:任务执行图(按秘密级规定执行)图1 青蒿素研发的组织管理模式

(二)青蒿素的发现

中草药治疗疟疾在我国有几千年的历史,民间蕴藏着极其丰富的经验。为了把散在的科学经验用科学方法加以总结提高,科研人员进行了大量民间调查,先后有7个省市和相关部属单位全面开展了抗疟药物的调研普查和筛选研究,到1969年筛选的化合物和包括青蒿在内的中草药有万余种,但未能取得理想结果[12,17]。

原卫生部中医研究院所属的中药研究所的团队[13]从本草研究入手,广泛收集、整理历代医籍,查阅群众献方,请教老中医专家历经3个月时间,收集到包括内服、外用,植物、动物、矿物药在内的2000多个方药,并在此基础上精选编辑了包含640个方药的《疟疾单秘验方集》[12,18],以中医研究院革委会业务组的名义油印成册,于1969年4月送交全国“523”办公室。

1969年5月起,开始制备多种中药的水提取物、乙醇提取物,送请中国人民解放军军事医学科学院进行抗疟活性筛选,至6月底送样品50余个。其中,发现胡椒提取物对鼠疟疾模型疟原虫抑制率达84%。1969年7月,时值海南疟疾流行季节,全国“523”办公室建议中医研究院中药研究所参与任务的科研人员去现场体验实际情况,并提出在上半年筛选样品中对鼠疟疾抑制率较高的胡椒及辣椒加明矾可带去做临床疗效观察。

在海南疟疾疫区的临床验证发现,尽管胡椒和辣椒加明矾的多种制备样品对鼠疟疾实验治疗的抑制率达80%以上,但对疟疾患者只能改善症状,不能使患者的疟原虫转阴。1970年9月,进一步扩大筛选范围包括植物药的筛选,矿物和动物药筛选等。同时,筛选工作离不开动物模型,在军事医学科学院微生物流行病研究所等机构的帮助下,中药所建立了鼠疟疾动物模型。1971年9月初,筛选了100余个中药的水提取物和醇提取物200余种,但结果并不理想,没有出现重大成果。经中医专家等多领域专家商讨,并对既往研究过药物的历代文献进行重新梳理,发现关于使用青蒿素减轻疟疾症状的唯一参考文献出现在东晋葛洪《肘后备急方》有关 “青蒿一握,以水二升渍,绞取汁,尽服之”的截疟记载[15, 19]。于是考虑到提取过程可能需要避免高温,由此改用低沸点溶剂的提取方法。190次实验失败后,在 60 ℃用乙醚萃取, 制成了一种无毒性的第 191 号中性抽提物,它对感染伯氏疟原虫小鼠及感染猴疟原虫猴的疟原虫血症显示100%的疗效[20]。1971 年我国科学家屠呦呦发现黄花蒿的乙醚提取物具有抗疟疾活性;1973 年,抗疟疾的有效单体青蒿素被提炼获得;1976 年,中科院上海药物所对青蒿素进行结构改造,经筛选获得抗疟活性更高的蒿甲醚。1977 年,《一种新型的倍半萜内酯——青蒿素》正式发表,清晰地向公众公开了青蒿素的分子结构,以及确认分子结构所必需的红外光谱、质子共振谱、X射线单晶衍射等方法[21]。

(三)青蒿素-化学研究

1.青蒿素提取工艺/青蒿素的提取与分离:1971年下半年,中医研究院中药研究所(屠呦呦教授等)用乙醚提取法分离到中药青蒿(植物黄花蒿)的抗疟有效部位之后,随即开展了抗疟有效单体提取分离的研究,分离到对鼠疟有抑制作用的青蒿素Ⅱ(后称青蒿素)[22]。1973年云南省药物研究所和山东省中医药研究所随后开始了黄花蒿中抗疟有效成分的提取和分离,云南省药物研究所发现昆明产的大头黄花蒿叶的乙醚等粗提取物对鼠疟有较强的抑制作用, 其乙醚粗提取物经硅胶柱层析得到一种无色针状结晶,经过药效学过筛结果证明,此结晶为抗鼠疟的活性成分。同年6月,从重庆酉阳地区购得的市售青蒿(原植物为黄花蒿)叶中分离同一抗疟有效成分,按国际天然产物命名的原则,命名黄蒿素。1974年,对黄蒿素提取方法进行了改进,建立了简便易行、适用于工业化生产用的黄蒿素“溶剂汽油提取法”,此方法为昆明制药厂和山东中医药研究所建立吨级以上青蒿素提取方法奠定了基础。1973年11月,山东省中医药研究所从当地生产的黄花蒿中也分出到抗疟有效单体黄花蒿素,但该所使用的丙酮提取法也并未正式形成生产工艺。此外,广西植物研究所、桂林芳香厂对黄花蒿素最初的提取、分离法与中药研究所的烯醇法基本一致,后改用“120#汽油提取法”等进行提取[23]。

2.青蒿素分子结构测定:根据青蒿素的元素分析、质谱、红外光谱、核磁共振谱,相关研究人员判定其分子式为C15H22O5,属倍半萜类化合物。在先后借鉴了已做过的化学反应(氢化反应、硼氢化钠还原反应、酸降解反应、碱降解反应等)和过氧基反应及由波谱数据推断出了青蒿素的一些分子结构片段[24], 并参考了南斯拉夫化学家在同一植物中分离到的青蒿乙素的结构[25],最终中国科学院生物物理研究所利用X射线晶体衍射法于 1975 年年底确证了青蒿素的相对构型[21]。随后,利用反常散射进一步确定了青蒿素的绝对构型。青蒿素的化学结构与已知的抗疟药完全不同,其为一个含有过氧基团的倍半萜内酯。

(四)青蒿素-药理学研究

通过梳理20世纪70年代后期至80年代初公开发表的文献[26-40],结果表明,国内早期开展青蒿素抗疟疾作用药效和毒理研究的主要有以下单位:中医研究院中药研究所、军事医学科学院、中国科学院上海药物研究所、中国医学科学院药物研究所、中国预防医学科学院寄生虫病研究所、中国科学院原子能研究所、中国科学院上海有机化学研究所、北京师范大学、第二军医大学、广州中医药大学、广州中医学院、山东省中医药研究所、四川省中药研究所、广西医学院、广西中医药大学等单位。

1.青蒿素抗疟药效的研究:相关研究对青蒿素及其衍生物的抗疟药效学做了大量研究工作,包括青蒿素类对鼠疟和猴疟的红内期及体外培养鼠疟原虫和人恶性疟原虫的作用,对鸡疟、鼠疟和猴疟的组织期作用,以及抗药性等研究,全面评价了青蒿素的抗疟效果[26-34]。体内实验方面,鼠疟实验表明青蒿素的抗疟作用迅速,抑制作用明显。青蒿素在体内对伯氏鼠疟原虫和食蟹猴疟原虫模型的红内期均有良好的杀灭作用,对组织期无效。主要局限性为3～4 d的短疗程复燃率高,以口服有效量肌内注射,可以减少复燃。

2.青蒿素毒理学研究:在青蒿素抗疟作用受到广泛关注的同时,其在人体使用及动物实验产生的、与药物安全相关的毒理学问题同样备受关注。相关研究发现,青蒿素在临床应用时,对各型疟疾的患者毒副作用较低,不良反应较少,治疗窗口较宽[26, 35-39]。在实验室范围,对其进行的毒理学评价研究,为充分展示其毒性,常使用较大剂量和较长的给药时间,也会显示出较多的毒性,但毒性反应是可逆的。

3.青蒿素药代动力学研究:关于青蒿素药代动力学研究的报道,最早见于1977 年全国放射性同位素技术经验交流会发表的“3H-青蒿素和3H-还原青蒿素在小鼠体内吸收、分布、排泄和代谢的初步研究”,迄今已有46年的历史。最早的国际报道见于 1981年10月在北京召开的WHO疟疾化疗科学工作组第四次会议上发表,随后以中国抗疟药青蒿素及其衍生物研究协作组的名义发表。相关研究结果显示,青蒿素具有吸收快、分布广、代谢与排泄快的特点[40-41]。

(五)青蒿素的临床研究

东直门医院进行的人体试药观察显示,未发现青蒿素存在明显的不良反应,之后开始做临床试验[26], 1972年8月24日至10月初在海南昌江地区用青蒿的乙醚中性提取物(91#)对当地低疟疾流行区、外来人口的间日疟(11例)、恶性疟(9例)、混合感染(1例)进行临床验证,对照观察为氯喹治疗恶性疟(3例)、间日疟(1例),结果表明91#药对当地、低疟疾流行区、外来人口的间日疟和恶性疟均有一定的效果,尤其是对间日疟患者,其有效率达100%,此外还发现剂量越高,效果越好。广东海南抗疟疾临床研究协作组在海南岛的抗疟区,采用口服或肌内注射青蒿素的方法,对 65 例和48例抗氯喹疟疾患者进行治疗和观察,结果显示该方案安全可行且疗效显著[42-43]。1976年6—10月,在江苏高邮县5个实验区的26个观察点共服用青蒿素预防疟疾24万多人次,发病率比1975年同期下降50%,而用青蒿素治疗现症间日疟患者201例,有效率达89%[12]。自1972年以来,全国10个省、市和自治区用中药青蒿制剂和青蒿素制剂在海南、云南、四川、山东、河南、江苏及湖北恶性疟疾、间日疟疾流行地区进行了6555例临床验证。其中,青蒿素治疗2099例,包括恶性疟 588 例(含脑型疟 141 例)、间日疟 1511 例[44],证明在速效、低毒方面,优于氯喹和其他抗疟疾药物,以及在治疗间日疟疾及恶性疟疾也有显著效果。对于单纯恶性疟的治疗选择双氢青蒿素和哌喹联用,对于重症恶性疟的治疗选择静脉注射青蒿琥酯。到目前为止,对重症疟疾进行的最大的随机临床试验显示,静脉注射或肌内注射青蒿琥酯比肠外奎宁给药更能大副降低病亡率。因此,在2011年,WHO 建议以青蒿琥酯代替奎宁作为严重疟疾患者的一线治疗药物。总之,青蒿素的抗疟疾疗效是突出的,作为治疗药物,与同期其他抗疟疾药物相比,具有速效和低毒的特点,尤其是在救治脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾方面达到了国际先进水平。

“523任务”历时13年,全国60多家科研单位、500多名科研人员参与,取得以青蒿素为代表的、具有国际先进水平的科研成果89项,荣获全国科学大会奖15项,荣获国家部委、省市科学成果奖12项[12]。尽管目前疟疾在全球范围内的流行仍很严重,但90%的患者在非洲大陆,并依然是非洲大陆上最严重的疾病。我国已经得到了有效的控制,2021年6月 30日,WHO宣布中国获得无疟疾认证[45]。此认证标志着疟疾在中国肆虐数千年的历史结束了,在中国公共卫生史和全球消除疟疾史上具有重要的里程碑意义。青蒿素的成功经验给目前结核病防治等方面带来一些启示,值得我们借鉴、学习和反思。

青蒿素成功经验

青蒿素类抗疟疾药物的发现是全球抗疟疾药物发展史上的里程碑,它是在特殊的历史背景下,由科研计划组织下的全国多部门、多学科尽心协作、相互配合取得的重大成果,是继承发扬我国传统医药宝库的成功范例。

1．需求是第一导向。20世纪60年代,全国疟疾肆虐,我国各地疟疾流行严重,恶性疟原虫对氯喹产生抗药性的问题也十分严重,预防、治疗疟疾并控制疟疾的流行,是当时国家亟待解决的问题。此外,我国面临援外和备战,因此,疟疾防治研究也是我国在西方封锁下的抗疟疾严峻形势的迫切要求。

2．中国古籍、传统中医药的优势。善于从我国古籍中寻找灵感,挖掘中医药研发潜力。中医药有效成分及化学结构多样性,更利于开展寄生虫病及尚无有效疫苗的传染病的相关医药产品研发,例如青蒿素就是从中医古籍提示低温提取青蒿素的关键突破点。此外,加强传统中医药与现代医学结合,基于传统医学证据锁定候选药物,并遵循现代药物研发程序快速开发候选药物,例如青蒿素采用现代药物开发流程,包括有效成分提取、实验室安全性检测和临床实验等。

3．体制优势。尽管当时我们国家经济基础和科研条件都很薄弱,但凭借体制优势,迅速组织几十家单位、数百名科研工作者参与,协作攻关,在较短时间内完成创新任务,速度之快,效果之好,突破了当时物质条件的局限,超过了当时同样在寻求抗疟疾突破的发达国家。这种体制的优势在于能够整合创新环节,将分布式、碎片化的资源迅速调动集中,在解决重大、关键、迫切的创新项目上突破局限,取得开创性成果。

青蒿素研发成功经验对结核病防控带来的思考

青蒿素的成功为中医药走向世界打开了一扇崭新的窗户,对我国结核病防治也具有诸多启示作用,应当认真从中汲取成功经验,有助于实现终止结核病的目标。

1．加大政府承诺,发挥体制优势,开展有组织的中西医联合、多学科交叉的科研攻关工作,重视“科学家精神”对科研工作的重要引领作用。青蒿素类药物被世界认可和巨大成功,离不开中央和地方各级政府对疟疾防控工作的重视。也离不开全国大协作,即“523任务”组织了近千名化学、生药学、药物化学、药理学、毒理学、药剂学、临床医学、工艺研究和工业部门等科学技术人员, 以及负责523任务的组织和行政管理人员良好的合作和辛勤的努力。我国结核病负担居全球第3位,在新形势下,面对如何控制结核病的问题,应制订相应政策和管理模式,促进科技创新,新药的创制必须有强有力的领导, 要有一支稳定的、具有奉献精神的科研队伍, 要有团结协作的良好风气和相应配套的政策,培育一批高水平的中青年研究骨干人才,促进中医药融入我国公共卫生和传染病防控体系。此外,对跨地区的合作应建立有效的信息共享机制,确保所有研究部门在最新突破的基础上持续推进,提高研究效率,将对控制结核病起到有力的推动作用。

2．借鉴我国传统中医药文化,善于从中药和民间寻找药物或先导物,实现传统中医药与现代医学相结合。在“523任务”的诸多研究项目中, 有一个课题是“民间防治疟疾有效药物疗法的重点调查研究”, 这个研究小组获得了初步成果, 例如从植物鹰爪分离出有效抗疟疾单体鹰爪甲素, 从陵水暗罗中分离出暗罗素的金属化合物, 对常山乙碱的结构改造, 以及青蒿素等。我国传统中医药对结核病的认识与防治已有几千年的历史,其始见于医学专著《黄帝内经》所记“虚痨”之症。在汉代时期,华佗《传尸论》是传统医学中最早提出“痨病传染”之说的古代医著;唐代时期,王焘在《外台秘要》提出肺虫致病说:肺痨热,损肺生虫,生肺虫,在肺为病;元代时期,《十药神书》收载十方,为我国现存的第一部治疗肺痨的专著。在明代,《医学正传·劳极》确立了杀虫与补虚的两大治疗原则。在西方医学没有传入我国之前,我国传统中医药对结核病的治疗发挥了重要作用。目前,我国耐多药结核病的治疗成功率只有52%,在目前西医化学治疗抗结核新药仍未突破瓶颈,如何进一步提高耐药结核病治疗成功率,还需通过总结青蒿素研发经验和技术路线,利用现代医学技术发掘中草药(甚至扩大到植物来源的天然产物)的有效成分和作用机制,开展高质量临床研究,启发更多中药来源的有效药物研发,通过挖掘古籍文献,基于传统医学证据迅速锁定候选药物,遵循现代药物研发程序快速开发候选药物等方法进行解决。

3．加大经费投入及扩大国际合作渠道。青蒿素类抗疟疾药系我国首创药物且为国际热门课题, 我们有必要对青蒿素及其衍生物进行深入研究。政府部门和学术界要主动提供理论指导和政策支持,增加科技经费投入,支持建立若干高水平的中西医联合科技创新研发平台,提升中医药对我国重大传染病防治的贡献度,充分发掘中医药宝库。近年来,越来越多的研究证明传统中医药作为结核病的辅助治疗发挥了重要作用,尽管距新药的发明还有很长的路, 但也已看到了希望。

青蒿素的研究成功在特殊的历史背景下,体现了我国社会主义制度的优势,建立了科学精准的疟疾防控策略和灵敏高效的报告、检测、治疗、监测和应急处置体系,积累了多部门和区域联防联控以及边境地区防控合作机制系列的中国经验,也是我国医药科技人员坚持走中西医药结合道路,是继承与发扬祖国医药学遗产的一项重大科研成果,为全球抗疟疾贡献了中国智慧。其经验也可以为结核病及其他相关疾病寻找相应药物提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献曹玉清和尚希钰:检索文献、撰写论文;纪鑫毓:检索文献;熊一白和马艳:指导和修改论文