黄连解毒汤改善1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠瘙痒症状的作用及机制研究

张曾燕，张汇源，关建华，陈云龙（天津中医药大学，天津 301617）

特应性皮炎（Atopic dermatitis，AD）原称为“异位性皮炎”“遗传过敏性皮炎”，是皮肤科临床常见的与遗传过敏素质有关的慢性炎症性皮肤病，表现为皮肤干燥、瘙痒、多形性皮损并有渗出倾向，常伴发哮喘、过敏性鼻炎[1]。其中剧烈的瘙痒对患者身心健康造成严重危害，不仅会引起“瘙痒-搔抓”循环，加重皮损部位的皮肤屏障功能异常，促使AD症状进一步加剧，还会严重影响睡眠，甚至导致患者自卑以及抑郁等精神问题的发生，严重影响其生活质量[2]。因此，缓解AD的瘙痒症状是治疗AD的重要环节。

AD 瘙痒机制复杂，其中组胺受体以及胸腺基质淋巴细胞生成素（Thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、白细胞介素（IL）13、IL-31 等细胞因子在瘙痒的形成中发挥了重要作用[3]。经典的瘙痒途径是由特异性IgE 抗体介导的I 型超敏反应，肥大细胞活化脱颗粒，释放组胺，与组胺受体结合后引发瘙痒神经信号传导，从而导致瘙痒的产生[4]。因此，组胺受体拮抗剂如H1、H4受体拮抗剂已被广泛应用于银屑病和AD等伴有瘙痒症状的皮肤炎症治疗中[5-8]。TSLP在AD 的发病中同样具有重要作用，不仅可促进Th2细胞分化以及引发瘙痒，还与AD的持续时间、严重程度和表皮屏障功能息息相关[9]。IL-13、IL-31是典型的Th2 相关细胞因子，被认为是AD 发病机制与治疗的关键靶点。IL-13、IL-31在AD患者皮肤组织中的表达显著上调，IL-13可激活神经元上的IL-31R后传导瘙痒，诱发抓挠行为，而阻断IL-31可显著缓解AD患者的瘙痒症状[10-11]。

黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子4味中药组成，是清热解毒的经典方剂，具有抗菌、消炎、抗肿瘤、调节免疫等多种药理作用[13]。临床上黄连解毒汤常用于AD、接触性皮炎等皮肤病的治疗，疗效确切[14-16]。但黄连解毒汤是否能有效改善AD 导致的瘙痒症状仍缺乏直接证据。故本研究拟通过构建AD小鼠模型，探讨黄连解毒汤改善AD小鼠瘙痒症状的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物36 只6～8 周龄雌性Balb/c 小鼠，SPF 级，体质量（15±2）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。动物饲养于天津中医药大学动物中心SPF 环境，室内温度25 ℃，绝对湿度为73%，保持12 h 昼夜交替。本实验经天津中医药大学动物中心伦理委员会批准，动物伦理审批号：TCM-LAEC2022098

1.2 药物及试剂黄连解毒汤颗粒（黄连9 g、黄芩6 g、黄柏6 g、炒栀子9 g），购自天津中医药大学附属保康医院，批号：22032100171；每0.09 g 颗粒约相当于1 g生药。地塞米松（Dexamethasone，DXMS），购自美国Sigma 公司，批号：C11951421；1-氯-2，4-二硝基苯（DNCB），购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，批号：WT6CA-RR；丙酮，购自天津市风帆化学试剂科技有限公司；橄榄油，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：K1809057；异氟烷，购自深圳瑞沃德生命科技有限公司，批号：21080701；脱毛膏，购自利洁时家化（中国）有限公司；总RNA 提取试剂盒，购自美国Promega 公司，批号：0000532549；一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂（批号：W0208）、SuperReal 荧光定量预混试剂增强版（SYBR Green，批号：W0026），购自天根生化科技（北京）有限公司；TSLP、IL-31、IL-13、组胺H4受体（HRH4）、GAPDH引物，均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 主要仪器JB-P5 型包埋机，武汉俊杰电子有限公司；RM2016型病理切片机，上海莱卡仪器有限公司；EVOS M7000型全自动活细胞荧光成像系统，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Scientz-48L 冷冻型高通量组织研磨器，宁波新芝生物科技股份有限公司；Bio-Rad T100型梯度PCR 仪、C1000 Touch 型热循环仪，伯乐（上海）有限公司。

1.4 模型复制、分组及给药将36只6～8周龄的雌性Balb/c 小鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组（阳性对照，2.5 mg·kg-1）及黄连解毒汤低、中、高剂量组（0.4、0.8、1.6 g·kg-1），每组6只。

实验流程见图1。实验开始前（第0 天），使用剃毛器剃除小鼠背部毛发，将脱毛膏涂抹于小鼠背部，停留3 min，彻底除去小鼠背部毛发。然后使用DNCB 溶液［将DNCB 溶于丙酮-橄榄油（3∶1）溶液］复制AD 小鼠模型。实验开始后，第1、2、3 天将200 μL 1% DNCB 溶液均匀涂抹于造模组（除正常组外的其他各组）小鼠的背部进行致敏；从第14 天开始，每3 d 将200 μL 1.5% DNCB 溶液涂抹于造模组小鼠背部进行激发，共进行5次；正常组小鼠致敏与激发均使用等体积的丙酮-橄榄油溶液涂抹。

图1 1-氯-2，4-二硝基苯（DNCB）诱导特应性皮炎小鼠的实验设计与药物干预流程Figure 1 Experimental design and treatment schedule of 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（DNCB）-induced atopic dermatitis mice

激发与药物干预同时进行，各组按照设定剂量对小鼠进行灌胃给药，每日1次，连续14 d。根据《药理学实验方法》[19]设定给药剂量，黄连解毒汤颗粒低、中、高剂量（0.4、0.8、1.6 g·kg-1）分别相当于约4.55、9.10、18.20 mg·kg-1生药剂量。正常组、模型组小鼠灌胃生理盐水，各组灌胃体积为10 mL·kg-1。

1.5 皮损严重程度评分实验终点前（第28 天），记录所有小鼠造模部位的皮损图片，参照特应性皮炎评分标准（Scoring atopic dermatitis，SCORAD）[20]，根据小鼠皮肤红斑、渗出或结痂、干燥或脱屑、表皮脱落以及苔藓化的严重程度进行赋分：0 分为未出现，1分为轻度，2分为中度，3分为重度。

1.6 抓挠次数测定第28 天，将每只小鼠单独放置于安静环境中，适应10 min 后，记录20 min 内每只小鼠后肢抓挠身体任意部位的次数。

1.7 HE 染色法观察皮损组织病理形态变化实验终点处死小鼠，取小鼠背部皮损部位皮肤组织，用4%多聚甲醛溶液固定；石蜡包埋、切片；将切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后，进行常规HE染色；切片经梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，中性树脂封片；采用全自动活细胞荧光成像系统进行全切片拍摄，并使用CaseViewer软件采集分析皮损组织染色切片的炎症浸润及表皮增厚情况。

1.8 甲苯胺蓝染色法观察皮损组织肥大细胞浸润情况取小鼠背部皮损部位皮肤组织，用4%多聚甲醛溶液固定；石蜡包埋、切片；经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后，将切片浸入甲苯胺蓝染液2～5 min；水洗，0.1%冰醋酸稍分化，自来水洗终止反应，显微镜下控制分化程度；将切片置于烤箱烘干后，用二甲苯透明10 min，中性树胶封片；在显微镜下用全自动活细胞荧光成像系统进行全切片拍摄，并使用CaseViewer软件采集分析皮损组织染色切片中肥大细胞浸润情况。

1.9 RT-qPCR 法检测皮损组织中TSLP、IL-13、HRH4、IL-31 mRNA 表达水平收集各组小鼠背部皮损组织，严格按照总RNA 提取试剂盒说明书步骤操作，提取皮肤组织总RNA。使用反转录试剂盒将总RNA 反转录为cDNA，反转录条件：20 μL 反应体系，42 ℃、15 min，95 ℃、3 min。使用荧光定量预混试剂进行PCR扩增反应，反应体系为25 μL，采用两步法反应程序：95 ℃、15 min 预变性；95 ℃、10 s 变性，60 ℃、32 s 退火/延伸，采集荧光信号，共循环40 次。反应结束后，根据扩增曲线及熔解曲线判断PCR反应特异性。结果以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达水平，并进行统计分析。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列见表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

1.10 统计学处理方法采用Graphpad Prism 8.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD 检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄连解毒汤对AD 小鼠皮损严重程度评分的影响结果见图2。持续观察28 d，正常组小鼠背部皮肤均无任何明显变化。与正常组比较，模型组小鼠的背部皮肤经DNCB激发后出现明显的红斑、苔藓化、结痂、表皮脱落等现象，皮损严重程度评分显著增高（P＜0.001）。与模型组比较，黄连解毒汤低、中、高剂量组小鼠背部的皮损情况得到明显改善，苔藓化面积明显缩小，皮损严重程度评分显著降低（P＜0.001）。结果表明，黄连解毒汤可显著改善AD 小鼠的皮损情况。

图2 黄连解毒汤对1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠皮损严重程度评分的影响（±s，n=6）Figure 2 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on skin lesion severity scores of atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=6）

2.2 黄连解毒汤对AD 小鼠皮损组织病理形态变化的影响结果见图3。正常组小鼠皮肤结构的各层次清晰完整，未见增厚，无明显炎性浸润。与正常组相比，模型组小鼠表皮角化过度，棘层厚度显著增加（P＜0.001），海绵水肿，真皮层内可见大量炎性细胞浸润。与模型组比较，黄连解毒汤中、高剂量组棘层厚度显著降低（P＜0.001），真皮层内炎性细胞数量显著减少。结果表明，黄连解毒汤可显著改善AD小鼠的皮肤病理损伤，降低炎性细胞浸润水平。

2.3 黄连解毒汤对AD 小鼠皮损组织肥大细胞浸水平的影响结果见图4。与正常组比较，模型组小鼠皮损组织肥大细胞数量显著升高（P＜0.001）。与模型组比较，黄连解毒汤低、中、高剂量组小鼠皮损组织肥大细胞数量显著降低（P＜0.001），且呈剂量依赖性。结果表明，黄连解毒汤可降低AD小鼠皮损组织的肥大细胞浸润水平。

图4 黄连解毒汤对1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠皮损组织肥大细胞浸润水平的影响（甲苯胺蓝染色；±s，n=6）Figure 4 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on mast cell infiltration in skin lesions of atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（Toluidine blue staining；±s，n=6）

2.4 黄连解毒汤对AD 小鼠抓挠次数的影响结果见图5。与正常组比较，模型组小鼠20 min内的抓挠次数显著增加（P＜0.01）。与模型组比较，黄连解毒汤高剂量组小鼠20 min 内的抓挠次数显著减少（P＜0.01）。结果表明，黄连解毒汤可缓解AD小鼠的瘙痒情况。

图5 黄连解毒汤对1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠20 min 内抓挠次数的影响（±s，n=6）Figure 5 Effect of Huanglian Jiedu Decoction on the times of scratches in 20 minutes of atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=6）

2.5 黄连解毒汤对AD 小鼠皮损组织中TSLP、IL-13、HRH4、IL-31 mRNA 表达水平的影响结果见图6。与正常组比较，模型组小鼠皮损组织中TSLP、IL-13、HRH4、IL-31 mRNA 表达水平均明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组比较，黄连解毒汤低、中、高剂量组小鼠皮损组织中IL-13、HRH4、IL-31 mRNA表达水平均显著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），黄连解毒汤高剂量组小鼠皮损组织中TSLP mRNA 表达水平明显降低（P＜0.05）。

图6 黄连解毒汤对1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠皮损组织中TSLP、IL-13、IL-31、HRH4 mRNA 表达水平的影响（±s，n=6）Figure 6 Effects of Huanglian Jiedu Decoction on mRNA expression levels of TSLP，IL-13，IL-31 and HRH4 in skin lesions of atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=6）

3 讨论

中医学将特应性皮炎（AD）归为“四弯风”范畴，认为AD发病与五脏相关，内有湿热为患，外有风湿热邪蕴于皮肤，内外合邪所致[3]。根据发病特点可将AD 分为多种证型，其中急性期AD 为“湿热蕴肤”型，血热而肉湿[12]，宜用清热解毒、燥湿类药物。黄连解毒汤是清热解毒的经典方剂，具有良好的抗炎、抗过敏作用，能有效改善AD症状。Chen Y等[17]通过对RAW264.7及RBL-2H3细胞进行黄连解毒汤体外抗炎研究发现，其可通过减少NO、IL-1β、GM-CSF等炎症介质的分泌，抑制Ca2+内流及β-己糖胺酶释放，降低MAPKs 磷酸化水平，抑制NF-κB 的激活等途径发挥抗炎作用。Chen Y 等[18]进一步研究发现，黄连解毒汤可改善AD 小鼠的皮肤屏障功能，通过调控MAPKs 和NF-κB 信号通路，下调血清与皮损组织中IL-4、TNF-α 的表达水平，降低小鼠皮肤炎症水平，从而改善AD小鼠的皮损症状。

AD 是一种慢性炎症性皮肤病，剧烈瘙痒是其典型特征之一，以伴有红斑所致瘙痒最为常见，其次有痒觉敏感和痒觉异常，也可表现为夜间瘙痒伴睡眠障碍。剧烈瘙痒导致患者不断抓挠瘙痒部位，持续的抓挠将会进一步导致表皮角质细胞损伤，促进炎性警报素的释放，直接或间接激活Th2 免疫细胞，进而导致角质细胞和免疫细胞释放大量引起瘙痒的细胞因子。当这些引起瘙痒的细胞因子与痒觉神经元结合，从而诱导患者进一步抓挠的欲望，造成AD患者“瘙痒-搔抓”的恶性循环，从而诱发或加重AD炎症[21]。本研究结果显示，给予AD小鼠连续灌胃黄连解毒汤14 d，抓挠次数显著减少，表皮炎性细胞及肥大细胞浸润明显减少，棘层厚度明显降低。结果提示，黄连解毒汤可通过缓解瘙痒，修复小鼠皮肤损伤，改善表皮屏障功能障碍，从而发挥改善AD的作用。

AD 瘙痒发生机制复杂，涉及遗传性或获得性皮肤屏障功能障碍、免疫调节异常、神经敏化或可塑性改变等[22]。组胺是最早发现的致痒介质之一，与组胺受体结合后可引发瘙痒。有研究[23]表明，与正常组小鼠相比，AD 小鼠的搔抓次数及血清组胺水平均显著升高。组胺H4受体（HRH4）广泛存在于AD患者肥大细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞及角质形成细胞（Keratinocytes，KC）表面[24]。组胺H4被释放后，可与神经纤维上的HRH4结合，激活瘙痒相关的离子通道即瞬时受体电位（Transient receptor potential，TRP）家族中的TRPA1，从而诱发瘙痒[25]。

急性期AD 以Th2 型免疫反应为主，慢性期以Th1 型免疫反应为主[26]。在AD 急性期，Th2 细胞亢进，IL-4、IL-5、IL-13 等Th2 型细胞因子分泌增多，其中IL-4 与IL-13 在AD 发病中具有重要作用。IL-4 与IL-13 可促进B 细胞活化，产生大量IgE，进而导致肥大细胞活化脱颗粒，释放组胺、5-羟色胺、白三烯、前列腺素等炎症介质，引发瘙痒，加重AD 症状[27]。此外，IL-4、IL-13 与KC 上的受体结合后，可下调丝聚蛋白（Filaggrin，FLG）、兜甲蛋白表达，从而导致表皮屏障功能障碍[28]；并且可诱导KC 分泌胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）、IL-33 等炎症因子，进而促进IL-31等瘙痒介质的产生[29]。

TSLP在急、慢性AD患者皮损组织中高表达，而在非皮损组织中则不表达；KC释放的TSLP直接作用于TRP 家族中的TRPA1 阳性感觉神经元子集，诱发瘙痒[30]。最近一项研究[31]表明，TSLP 可诱导KC 分泌骨膜蛋白，与感觉神经元亚群上表达的骨膜蛋白受体结合而引起瘙痒。此外，TSLP 可诱导CD4+T淋巴细胞向Th2分化，促进IL-4、IL-13、IL-31等Th2型细胞因子的产生，促进炎症反应，并激活感觉神经元而间接引起瘙痒[32]。

余何等[33]在观察玉屏风散对AD 大鼠瘙痒症状的干预效果时发现，与正常组大鼠相比，AD 大鼠的瘙痒程度及皮损组织中IL-31 的表达水平均显著升高。IL-31 诱发瘙痒的机制也与TRP 家族密不可分，IL-31 可通过结合背根神经节神经元表面的IL-31R，从而激活TRPA1、TRPV1，进而诱发瘙痒[34-35]。在TRPV1、TRPA1缺陷小鼠皮肤及鞘内注射IL-31，其诱导产生的瘙痒明显降低[36]。也有研究[37]认为，IL-31 并非直接作用于神经而诱发瘙痒，而是通过影响KC及其次级介质来诱发延迟性瘙痒。

本研究结果显示，经黄连解毒汤（尤其是中、高剂量）治疗后，AD小鼠皮损组织中的棘层厚度及肥大细胞数量明显降低，与瘙痒相关的TSLP、IL-13、IL-31、HRH4 mRNA 表达显著下调，抓挠次数显著减少。同时，地塞米松也可显著下调AD小鼠皮损组织中IL-13、IL-31、HRH4 mRNA表达，但并未显著改善AD小鼠的抓挠行为，可能与地塞米松未能显著下调AD 小鼠皮损组织中TSLP mRNA 的表达有关，类似现象也出现在低剂量黄连解毒汤组。而高剂量组黄连解毒汤能显著下调TSLP mRNA表达，AD小鼠抓挠行为也得到明显改善。结果提示，TSLP在AD瘙痒发生机制中具有十分重要作用，可能通过引起“瘙痒-搔抓”循环和皮肤屏障功能降低而更早地参与AD 的进展。因此，调节皮损组织中的TSLP 表达能有效改善AD瘙痒症状及皮肤屏障功能，减轻皮肤炎症。目前，针对TSLP-OX40L-OX40 轴治疗AD 的药物GBR830已进入临床试验阶段，该药物可显著降低AD 患者湿疹面积的严重程度指数，减轻表皮增生，并降低皮损组织中Th1、Th2、Th17/22相关细胞因子和趋化因子的mRNA表达[38]。

综上所述，黄连解毒汤能够明显缓解AD 小鼠的瘙痒症状，改善皮损组织的炎性细胞及肥大细胞浸润，其机制可能与下调IL-13、IL-31、HRH4、TSLP mRNA 表达，进而改善皮肤屏障功能、降低炎症水平、抑制感觉神经元激活有关。