基于JAK2/STAT3信号通路探究象皮生肌膏对肛瘘术后模型大鼠创面修复的影响*

黄静雯，尹园缘，刘 颖，邹巍莹，程 扬，詹 敏，余 炼，宾东华，

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

肛瘘（anal fistula）是位于肛周皮肤和直肠之间的一个异常通道，由内口、瘘管、外口组成[1]。肛瘘占所有肛肠疾病的8%～25%，常见于中青年男性[2]。临床主要表现为：肛周疼痛，肛周硬结，肛瘘外口持续性或间断性流脓性及血性、黏液性分泌物，肛周皮肤瘙痒等[3]。肛瘘治愈率最高的治疗方法是手术，包括瘘管的开放和切除，但手术治疗只是第一步，术后创面的愈合尤为关键[4]。中医药在肛瘘术后创面的治疗中发挥了强大的优势，不仅可以缓解术后伤口疼痛，还能加快促进创面的愈合，缩短病程[5]。象皮生肌膏出自张山雷《疡科纲要》，是由象皮、鳖甲、生地黄、当归、炉甘石、血余炭、生石膏等药材制成的药膏，具有清热解毒止痒、活血消肿止痛、敛疮去腐生肌等功效[6]。湖南中医药大学第一附属医院对原方药物及药量进行化裁，并改进制膏工艺，将其制作成膏剂用于临床。研究[7]表明，象皮生肌膏能促进肛瘘术后创面恢复，缩短创面愈合时间，但目前对其与炎症反应相关的机制仍未完全明确。因此，研究象皮生肌膏作用于创面、促进创面愈合的机制具有重要意义。

现代网络药理学研究表明，炎症反应在造成肛瘘术后创面修复缓慢中至关重要[8]。白介素-6（IL-6）是具有代表性的炎症细胞因子，Janus激酶（JAK2）/信号传导及转录激活因子3（STAT3）信号通路是一条重要的炎症反应信号通路[9]，且IL-6能作用于JAK2/STAT3 信号通路并产生连锁反应。JAK2/STAT3信号通路相关蛋白[糖蛋白130（gp130）、磷酸化JAK2（p-JAK2）、JAK2、磷酸化STAT3（p-STAT3）、STAT3]可在肛瘘创面肉芽组织可表达。本实验通过研究JAK2/STAT3信号通路在肛瘘术后大鼠模型中的影响，探讨象皮生肌膏在肛瘘术后创面炎症反应中的作用机制，旨在为肛瘘术后创面恢复的临床指导用药提供进一步的依据。

1 材料

1.1 实验动物 36只SPF级健康成年的SD大鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供），动物生产许可号：SCXK（湘）2019-0004。雌雄各半，体质量210～250 g。动物饲养于湖南中医药大学第一附属医院实验中心，温度20～25 ℃，湿度50%～70%，12 h/12 h明暗光照。所有操作均遵循湖南中医药大学第一附属医院动物伦理委员会标准，伦理号：ZYFY20220225-01。

1.2 主要药物及试剂 象皮生肌膏（湖南中医药大学第一附属医院制剂室制备，湘药制字Z20070276，药品批次：20211212，组成：象皮、当归、生地黄、炉甘石、血余炭、生石膏等）；凡士林（湖南中医药大学第一附属医院制剂研究室制备）。苏木素-伊红染色液（广州维格斯生物科技有限公司，批号：20211217）；中性树胶（中国上海标本模型厂，批号：20220802）；二甲苯（批号：1919BA1016）、RIPA裂解液（强）（批号：111522230104）、BCA蛋白定量试剂盒（批号：111622230120）均购自上海碧云天生物技术有限公司；PVDF膜（美国Merck Millipore，批号：R1KB43735）；磷酸化gp130抗体[赛信通（上海）生物试剂有限公司CST，批号：20220218]；IL-6抗体（批号：20220307）、JAK2抗体（批号：20220425）、p-JAK2抗体（批号：20220316）、STAT3抗体（批号：20220215）、p-STAT3抗体（批号：20220310）均购自湖南艾方生物科技有限公司；Perfect Start Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技术有限公司，批号：Q51224）；DEPC水（德国Sigma公司，批号：G511BA0019）；RNase inhibitor（批号：01031869）、dNTPs（批号：962220F14W04）、Revert Aid Reverse Transcriptase（批号：91254552）均购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 主要仪器 显微镜（德国莱卡公司，型号：DM2000 LED）；电泳仪电源（北京六一生物科技有限公司，型号：DYY-7C）；双垂直电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号：DYCZ-24DN）；快速转膜仪（金斯瑞生物科技股份有限公司，型号：eBlotTML1）；酶标仪（美国伯腾仪器有限公司，型号：ELX800）；化学发光仪（上海勤翔科学仪器有限公司，型号：ClinxChemiScope 6000）；实时荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司，型号：Q1）；超微量核酸分析仪（杭州奥盛仪器有限公司，型号：Nano-200）。

2 实验方法

2.1 分组与造模 参照付小兵等[10]制定的肛瘘术后造模法并加以改进，将36只SD大鼠于实验室适应性喂养1周后，按照随机数字表法分为象皮生肌膏组、凡士林组、假手术组和模型组，每组9只。称量每只大鼠体质量，用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（4 mg/100 g），约5 min后麻醉成功。大鼠肛门部备皮后，用0.1%络合碘消毒备皮区域，再用50 mL注射针头从肛门插入，于肛门左侧（截石位3点）约1 cm处穿出，接着用约10 cm钢丝沿孔径穿入，拧紧钢丝固定，以上操作结束后大鼠生命体征平稳，无不良反应，大鼠肛瘘模型造模成功。观察30 d后，用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（4 mg/100 g），沿钢丝行瘘管切除术（假手术组除外），取瘘管下组织，术后棉球加压止血，大鼠生命体征平稳，无不良反应。

2.2 实验给药 模型组：每日于创面滴0.2 mL生理盐水，再覆盖无菌纱布固定，2次/d，连续滴液10 d。象皮生肌膏组：用约2 g象皮生肌膏做成的油纱条覆盖创面，再覆盖无菌纱布固定。换药2次/d，连续换药10 d。凡士林组：用约2 g凡士林膏做成的油纱条覆盖创面，再覆盖无菌纱布固定。换药2次/d，连续换药10 d。以上3组在用药前均使用生理盐水对创面进行清洗，再使用碘伏消毒创面，将肛门部残留粪便及坏死性分泌物清理干净后再用药治疗。假手术组未行瘘管切除术，不用给药治疗。

2.3 取材 给药第5、10天，按照随机数字表法于各实验组大鼠选6只，取肛瘘术后同一侧创面的同一部位约150 mg肉芽组织标本（假手术组取瘘管下正常肉芽组织标本），放入-80 ℃冰箱保存，或4%多聚甲醛固定保存。

2.4 观察指标

2.4.1 大鼠肛瘘术后创面愈合率 给药第3、5、7、10天，在大鼠肛瘘术后创面用0.25 cm×0.25 cm的无菌透明方格纸（爱孚贴）测量局部创面组织面积并记录，并与给药第0天时创面面积进行比较，获得各组的动态创面愈合率。计算公式为：创面愈合率（%）=（第0天创面面积-未愈合创面面积）/第0天创面面积×100%。

2.4.2 大鼠肛瘘术后创面肉芽组织形态 采用HE染色法（hematoxylin-eosin staining）观察各组大鼠肛瘘术后创面肉芽组织形态。将肛瘘术后创面肉芽组织固定于4%多聚甲醛，进行梯度脱水并包埋，切成约5 μm切片。苏木素染色液染5 min，自来水冲洗，分色液进行分化，再用自来水冲洗并反蓝切片。放入乙醇中梯度脱水，伊红染色5 min，最后中性树胶封片并观察。

2.4.3 创面肉芽组织IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相对表达量 采用RT-qPCR法测定创面肉芽组织IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相对表达量。向细胞或组织样本中加入500μL Trizol，向加有Trizol的1.5mL EP管中加入100μL氯仿，震荡混匀后，静置5 min，在12 000 r/min（离心半径为8.6 cm），4 ℃离心10 min（离心半径为8.6 cm）。从离心机中取出1.5 mL EP管，再将上层无色透明的水相层吸入到另一干净的1.5 m LEP管中。样品分为3层，RNA位于上层水相中。加入等体积的异丙醇，上下轻轻颠倒混匀之后，静置10 min，再12 000 r/min（离心半径为8.6 cm），4 ℃离心10 min。离心之后在EP管壁或管底有胶状沉淀出现，为RNA。弃去上清，用1 mL 75%乙醇对RNA沉淀进行洗涤，7 000 r/min，4 ℃离心5 min（离心半径为8.6 cm），将上清去除干净。室温静置干燥，干燥10 min。所有EP管中加入25 μL的DEPC H2O，用枪头吹打几次，使RNA充分溶解，-80 ℃保存。在95 ℃反应45 s，95 ℃变性15 s，60 ℃退火40 s，进行45个循环。每组进行3次测定，取3次的平均值，图像分析仪扫描凝胶密度，采用2-△△CT法计算mRNA表达水平。RT-qPCR引物序列见表1。

表1 实验所用引物序列

2.4.4 创面肉芽组织IL-6、gp130、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白相对表达量 采用蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测创面肉芽组织蛋白表达水平。每组大鼠取40～60 mg肛瘘术后创面肉芽组织，提取总蛋白，BCA法定量蛋白浓度，然后进行电泳、电转，将PVDF膜完全浸在5% milk-PBST或5% BSA-PBST中，室温轻摇1 h，加入5% BSA-PBST稀释后的一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加入用PBST稀释后的二抗（1∶5 000），室温摇床孵育1 h，再进行PBST洗膜5次，每次6 min，加入ECLA和B液按体积1∶1混合后均匀滴在膜上，曝光成像，观察IL-6、gp130、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达的灰度值，用ImageJ软件分析灰度值，计算灰度系数比。

2.4 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以“均数±标准差”（）表示，组间比较以单因素方差分析（One-way ANOVA），多组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠创面愈合情况 3组大鼠行瘘管切除术后分别给以每组相应药物创面换药。给药第3天，3组大鼠创面面积较大，无红肿，有少量分泌物渗出。给药第5、7、10天，象皮生肌膏组创面面积缩小明显，新生肉芽生长较快；模型组及凡士林组大鼠创面减少面积小于同时间点象皮生肌膏组。给药第10天，象皮生肌膏组大鼠大部分创面愈合，创面四周边缘被毛覆盖；凡士林组和模型组大鼠创面未完全愈合，创面四周边缘被毛覆盖较少。象皮生肌膏组肛瘘术后创面愈合时间短，效果好。（见图1）

图1 各组大鼠不同时间段创面情况图

3.2 各组大鼠创面愈合率比较 给药第3天，模型组、凡士林组和象皮生肌膏组大鼠创面愈合率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。给药第5、7、10天，象皮生肌膏组、凡士林组大鼠创面愈合率高于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。给药第5、7、10天，象皮生肌膏组大鼠创面愈合率高于凡士林组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。所有大鼠不同时间创面愈合率比较，差异有统计学意义（P＜0.01），即存在时间效应；3组大鼠创面愈合率总体比较，差异有统计学意义（P＜0.01），即存在分组效应；时间与组别存在交互效应（P＜0.01），即各组大鼠给药前后创面愈合率上升幅度不一致。（见表2、图2）结果表明象皮生肌膏组和凡士林组主要在创面恢复的中、后期产生促进伤口愈合的作用，象皮生肌膏疗效更好。

图2 创面愈合率的交互效应轮廓图

表2 各组大鼠创面愈合率比较 （，%）

表2 各组大鼠创面愈合率比较 （，%）

注：F时间主效应=806.038，P时间主效应=0.000；F组别主效应=382.485，P组别主效应=0.000；F交互效应=50.567，P交互效应=0.000。与模型组比较，bP＜0.05；与凡士林组比较，cP＜0.05。

?

3.3 大鼠创面组织病理学 HE染色结果显示，象皮生肌膏组大鼠创面基本修复，成纤维细胞致密排列，少量炎症细胞浸润，血管丰富，组织结构完整，未见充血、水肿、糜烂等变化；凡士林组大鼠创面受损修复较差，血管有扩张出血，较多炎症细胞浸润，炎症反应明显，有新生肉芽组织；模型组大鼠创面表层出现明显出血及坏死，组织高度水肿，伴大量炎症细胞浸润，成纤维细胞分布散乱稀疏，未见新生毛细血管。与模型组比较，象皮生肌膏组和凡士林组炎症细胞浸润明显减少，成纤维细胞成熟且分布整齐，胶原纤维致密且排列整齐，可见新生毛细血管分布，创面修复较完整。（见图3）

图3 各组大鼠创面组织病理图 （HE，×200）

3.4 各组大鼠创面组织中IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相对表达量比较 象皮生肌膏组、凡士林组、模型组大鼠创面组织中IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相对表达量高于假手术组（P＜0.05）；象皮生肌膏组、凡士林组大鼠创面组织中IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相对表达量低于模型组（P＜0.05）；象皮生肌膏组大鼠创面组织中IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相对表达量低于凡士林组（P＜0.05）。（见图4～5、表3）

图4 荧光定量RT-PCR 检测IL-6、JAK2、STAT3 的动力学曲线

图5 荧光定量RT-PCR 检测IL-6、JAK2、STAT3 的融解曲线

表3 各组大鼠创面组织中IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA 相对表达量比较 （）

表3 各组大鼠创面组织中IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA 相对表达量比较 （）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与凡士林组比较，cP＜0.05。

?

3.5 各组大鼠创面组织中IL-6、gp130蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比较 给药第5、10天，象皮生肌膏组、凡士林组、模型组大鼠创面组织中IL-6、gp130蛋白相对表达量及p-JAK2/JAk2、p-STAT3/STAT3高于假手术组（P＜0.05）；象皮生肌膏组、凡士林组大鼠创面组织中IL-6、gp130蛋白相对表达量及p-JAK2/JAk2、p-STAT3/STAT3低于模型组（P＜0.05）；象皮生肌膏组大鼠创面组织中IL-6、gp130蛋白相对表达量及p-JAK2/JAk2、p-STAT3/STAT3水平低于凡士林组（P＜0.05）。给药第10天，象皮生肌膏组、凡士林组、模型组大鼠创面组织中IL-6、gp130蛋白相对表达量及p-JAK2/JAk2、p-STAT3/STAT3低于给药第5天（P＜0.05）。（见图6～7、表4）表明象皮生肌膏可以抑制肛瘘术后大鼠模型JAK2/STAT3信号通路的异常激活。

图6 给药第5 天大鼠创面组织中IL-6、gp130、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 蛋白表达Western blotting 图

图7 给药第10 天大鼠创面组织中IL-6、gp130、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3 蛋白表达Western blotting 图

表4 各组大鼠创面组织中IL6、gp130 蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 比较 （）

表4 各组大鼠创面组织中IL6、gp130 蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 比较 （）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与凡士林组比较，cP＜0.05；与给药第5天比较，dP＜0.05。

?

4 讨论

肛瘘最终获得根治的方案是个体化的手术治疗[11]。肛瘘发病部位为潮湿、有菌部位，且术后伤口创面通常是开放的。粪便、肠道细菌及一些物理因素导致术后伤口疼痛剧烈，愈合时间长，病程缓慢。因此手术后的创面愈合情况是疾病痊愈的重要标志[12]。与其他手术伤口类似，肛瘘手术后的伤口愈合也可分为3个阶段，即炎症渗出物期、纤维组织增生期和瘢痕面愈合期。在第一阶段，白细胞产生了各种炎症因子；在第二阶段，成纤维细胞、血管内皮细胞和上皮细胞参与血管生成和纤维增殖，诱导伤口处产生肉芽组织；在第三阶段，细胞外基质经历重组、降解和再合成，肉芽组织中的水分和血管减少，瘢痕组织形成[13]。在这些过程中，各种细胞因子起着重要作用，包括生长因子、炎症因子和基质金属蛋白酶（MMPs）等。炎症反应和血运是影响创面愈合的重要原因[14]。有针对性地干预可以有效缓解炎症反应，减轻术后疼痛，阻止并发症的发生，促进伤口快速愈合。因此术后及时正确的治疗是创面修复与愈合的关键。

中医学认为，肛瘘以“湿”“热”为病因，“毒”“瘀”为病理产物，四者共同构成以“湿、热、毒、瘀”为主的病机[15]。肛瘘手术后伤口难以愈合的原因是原有皮肤和肌肉受到金刃损伤。由于手术切除了病灶，而局部的湿热并没有排除，术后伤口表面处于瘀血、湿热的病理状态。因此肛瘘手术后伤口愈合的主要治法应是去腐生肌、清热祛湿、活血化瘀[5]。中医药治疗以清热解毒、祛邪生肌为主要治法。临床上有多种治疗方法，如中药内服方、中药软膏、中药坐浴、中药栓剂等。中药多靶点、多通路作用于创面，可改善创面炎症反应，调整局部血运，促进毛细血管的生成，从而促进伤口愈合。

肛瘘术后的创面愈合过程是由多因子参与且较为复杂的调控过程，炎症因子和生长因子参与了伤口愈合[16]。如：IL-6、IL-12、IL-1β和TNF-α等炎症因子的过表达通过影响成纤维细胞凋亡和胶原蛋白表达而导致伤口愈合缓慢；EGF、PDGF、VEGF、IGF-1R、TGF-β1、Ang-Ⅱ等生长因子通过诱导功能性血管生长，促进成纤维细胞和内皮细胞的分裂和增殖，从而提高创面愈合速度[17]。炎症反应是机体创伤后的基本防御性反应，是影响创面愈合的重要因素。IL-6为常见的炎症因子，可以促进机体炎症反应，同时机体炎症条件也能诱导产生IL-6，参与肛瘘术后多种并发症的发生与进展。研究证实，IL-6是重要的炎症细胞因子，也是一种多功能细胞因子，由纤维母细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、角质细胞及多种瘤细胞所产生，局部细菌大量产生和繁殖可导致IL-6升高，其升高水平与感染的严重程度一致[18]。近年来，研究证实IL-6/JAK2/STAT3信号通路与炎症性疾病、肿瘤及自身免疫性疾病的发病相关[19]。IL-6能作用于多种信号途径，IL-6能激活JAK2/STAT3信号通路。JAK2/STAT3信号通路能影响下游多种效应分子的活化状态，从而在细胞增殖、分化、凋亡、应激、炎症反应、免疫调节等起重要作用，是细胞内重要信号转导通路之一[20]。JAK2识别细胞外信号发生磷酸化激活后，能够使下游STAT3发生磷酸化；p-STAT3具有转录激活活性，能够调节下游多种基因的表达并参与凋亡、炎症的调控。IL-6能识别靶细胞表面IL-6受体（sIL-6R），并与其结合形成sIL-6R/IL-6复合物，进一步活化细胞膜表面gp130，诱导gp130二聚体和sIL-6R/IL-6复合物内信号的启动，从而激活JAK2，使受体酪氨酸激酶活化，并与STAT3蛋白结合。STAT3磷酸化能激活下游转录因子，调控炎症细胞因子的表达[21]。JAK2/STAT3蛋白含量越低，表示创面炎症反应越低。本研究结果表明，凡士林组、象皮生肌膏组小鼠创面组织中IL-6、gp130蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3均低于模型组，且象皮生肌膏组低于凡士林组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；象皮生肌膏组大鼠创面组织中IL-6 mRNA、JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相对表达量低于凡士林组与模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明象皮生肌膏可以抑制肛瘘术后创面肉芽组织中JAK2/STAT3信号通路并调控炎症反应。

象皮生肌膏具有促进创面修复与愈合的作用。象皮生肌膏组方中象皮有止血、敛疮之功；当归活血消肿止痛；生地黄清热凉血，生津滋阴；炉甘石止痒敛疮；血余炭消瘀止血；生石膏清热泻火解毒。诸药合用，具有祛瘀止痛、活血消肿、敛疮生肌之功[22]。影响肛瘘创面修复与愈合的重要因素之一为创面腐肉已净、新肉未生。象皮生肌膏可调节局部气血，活血消肿，最终达到生肌长肉的目的；且象皮生肌膏药物性状稳定性强，不易变质，外科常用于创面换药，具有显著的生肌效果。本课题组前期研究发现，象皮生肌膏可明显提高大鼠肛瘘术后创面愈合率，缩短创面愈合时间，其作用机制可能与降低创面组织中炎症反应因子表达有关[23]。本研究结果表明，象皮生肌膏组大鼠创面愈合率高于模型组及凡士林组。HE染色结果显示象皮生肌膏组创面炎症反应明显减少，且肉芽组织形成情况优于模型组及凡士林组，提示象皮生肌膏能促进大鼠肛瘘术后创面愈合，减轻创面炎症反应，调节创面愈合过程中的局部血运，缩短病程。

现代药理学研究表明，炉甘石、生地黄、生石膏与血余炭具有抗炎作用，炉甘石与地黄可止痒，石膏可镇痛，血余炭可抑菌、镇痛[24]。但目前尚无关于象皮生肌膏对gp130、JAK2、STAT3作用的有关报道。本研究选取JAK2/STAT3信号通路为切入点进一步探讨象皮生肌膏对肛瘘术后创面的作用机制。结果显示，象皮生肌膏组大鼠创面组织中IL-6、gp130蛋白相对表达量及p-JAK2/JAk2、p-STAT3/STAT3水平低于模型组与凡士林组。象皮生肌膏可通过抑制IL-6，从而抑制JAK-STAT通路的促炎性细胞因子或趋化因子分泌，减少大鼠肛瘘术后创面组织炎症反应，促进创面快速愈合。

综上所述，象皮生肌膏能通过刺激JAK2/STAT3信号通路有效抑制炎症反应，并增加血管生成、成纤维细胞激活，从而促进肛瘘术后创面修复及减轻创面水肿。但本研究仅采用实验性肛瘘术后大鼠模型开展研究，具有一定的局限性，且样本量相对较小，缺乏对肛门部微生物群的观察，缺乏临床试验等。今后的研究将通过体外研究和临床检测进一步探究象皮生肌膏促进肛瘘术后创面愈合的作用靶点及通路。