超声对小麦麸皮蛋白结构和功能性质的影响

许英一, 张 微, 王 宇, 王丽坤, 高海娟,王德香, 钱春荣, 刘 迪, 吴红艳, 谢吉莲

(齐齐哈尔大学食品与生物工程学院1,齐齐哈尔 161006)

(黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院2,齐齐哈尔 161005)

(黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所;农业农村部东北地区作物栽培科学观测实验站3,哈尔滨 150023)

小麦麸皮中含有质量分数13%～18%的蛋白质,包括醇溶蛋白、球蛋白、清蛋白和谷蛋白,是一种良好的蛋白质来源,蛋白中含有8种人体必需氨基酸,且含有较多的赖氨酸,其营养价值和生理价值都高于胚乳蛋白[1]。但由于其溶解性、乳化性等功能特性较差,限制了其在食品加工领域中的应用。通过对蛋白进行改性处理能够改变其疏水基团分布、空间排列构象以及氨基酸的组成等,进而改善蛋白的功能性质或开发新的功能特性[2]。目前关于蛋白的改性方法主要有酶法、物理法和化学法[3]。李帅斐[4]以新鲜脱脂米糠为原料,以氮溶解指数(NSI)为指标,通过均匀设计优化了碱法提取联合高温和酶法改性的工艺条件,通过高温和酶法改性得到的米糠蛋白NSI质量分数为96.08%,NSI提高非常显著,较改性前(68.32%)提高了 40.63%,酶法改性后的持水性、持油性、乳化性、乳化稳定性和发泡性等功能性质都得到了不同程度改善和提高。许英一等[5]采用葡萄糖、乳糖、壳寡糖、海藻酸钠对燕麦蛋白进行湿法糖基化改性,改性后4种燕麦蛋白的溶解性、乳化活性、乳化稳定性、持水性、吸油性等功能特性都显著提高(P<0.05)。酶法改性条件温和,但成本较高。化学改性可能会产生或引入有毒物质或影响食品风味的物质。相比较而言,超声波作为一种安全、环保、高效和无毒的新兴物理加工技术,可改变鹰嘴豆蛋白[6]、红豆蛋白[7]、芸豆蛋白[8]等功能特性,目前鲜见采用不同超声处理时间改性小麦麸皮蛋白(wheat bran protein,WBP)结构及功能性质的报道。研究以小麦麸皮为原料,探讨不同超声时间对WBP结构和功能性质的影响,以期为小麦麸皮的开发及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与设备

小麦麸皮;5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB);1-苯氨基-8-萘磺酸(ANS);β-巯基乙醇、氢氧化钠、盐酸等为分析纯;溴化钾为光谱纯。

JBT/C-YCL 400T/3P (D)超声药品处理机,SHA-C型恒温水浴振荡器,PC/PLCLD-53型真空冷冻干燥机,TDL-5A型台式离心机,PB-10型pH计,FJ300-S数显高速分散均质机,L-8900全自动氨基酸分析仪,Spectrum One型傅里叶变换红外光谱仪,TU-1901型紫外可见分光光度计,EnSpire多功能酶标仪。

1.2 实验方法

1.2.1 小麦麸皮蛋白的制备

采用碱法提取小麦麸皮蛋白。小麦麸皮磨粉过筛,正己烷脱脂。将脱脂后的小麦麸皮粉以料水比1∶12(g/mL)配制溶液,用1 mol/L NaOH 溶液调pH值为 10,在50 ℃水浴振荡3.5 h,10 000 r/min离心10 min,将上清液用1 mol/L HCl调pH至4.6,静置30 min,10 000 r/min离心10 min得沉淀,水洗沉淀2次,调pH至 7.0,冷冻干燥得到小麦麸皮蛋白(WBP),其蛋白质质量分数为(82.64±0.99)%。

1.2.2 超声改性处理

称取样品,配制质量浓度为50 mg/mL的WBP溶液,将pH调至7.0后磁力搅拌2 h至充分溶解,将蛋白溶液进行冰浴超声处理(温度不高于20 ℃)。设定超声药品处理机处理条件为:工作 4 s、间歇 2 s,超声频率为 20 kHz,超声功率为220 W,超声时间分别为0、5、10、15、30 min,冷冻干燥得到超声的小麦麸皮蛋白(UWBP),备用。

1.2.3 氨基酸含量的测定

采用氨基酸全自动分析仪酸水解法测定氨基酸含量,在适量样品中加入6 mol/L盐酸,封管,在110 ℃烘箱中水解24 h,待反应结束后,调节pH 2.2,用柠檬酸盐缓冲液(pH 2.2)定容。然后用注射器通过0.22 μm的滤膜,装入进样瓶,测定蛋白中的氨基酸含量[9]。

1.2.4 巯基和二硫键含量的测定

巯基及二硫键含量的测定参考Zhang等[10]的方法,稍作修改。称取120 mg样品加入20 mL Tris-Gly缓冲溶液(0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、0.004 mol/L EDTA、8 mol/L 尿素,pH 8.0)溶解,磁力搅拌1 h,10 000 r/min离心10 min,取上清液备用。游离巯基(SHF):取1 mL上清液,加入4 mL Tris-Gly缓冲溶液、0.05 mL Ellman’s试剂(用Tris-Gly缓冲液配制质量浓度为4 mg/mL的DTNB溶液),立即混匀,于25 ℃保温反应1h,以不加样品只加Ellman’s试剂为空白,测定A412游。总巯基(SHT):取1 mL上清液,加入4 mL Tris-Gly缓冲溶液、0.05 mL β-巯基乙醇,加入10 mL的12% TCA,室温反应1 h。10 000 r/min离心10 min后弃去上清液,沉淀用12% TCA洗涤2次,再次离心,收集沉淀,将其溶于10 mL Tris-Gly缓冲液中,取其中4 mL缓冲液,加入0.04 mL Ellman’s试剂,立即混匀,于25 ℃保温反应1 h,以不加样品只加Ellman’s试剂为空白,测定A412总。巯基和二硫键的计算如式(1)、式(2)所示。

游离巯基(SHF)或总巯基(SHT)/(μmol/g)=75.53×A412×DC

(1)

二硫键S-S(μmol/g)=SHT-SHF2

(2)

式中:A412分别为A412游和A412总;D为稀释倍数;C为样品质量浓度/mg/mL。

1.2.5 表面疏水性测定

表面疏水性测定参考许英一等[11]方法。配制一定质量浓度(0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4mg/mL)样品的磷酸盐缓冲溶液,加入20 μL 8 mmol/L ANS荧光探针,漩涡混合。室温下避光反应15 min,在激发波长390 nm,发射波长470 nm,狭缝5 nm的条件下测定蛋白与ANS结合物的相对荧光强度,以麦麸蛋白浓度为横坐标,相对荧光强度为纵坐标作图,线性回归曲线的初始斜率即为H0。

1.2.6 荧光光谱测定

内源荧光光谱测定参考李丹等[12]的方法,稍作修改。用0.01 mol/L、pH 7.0磷酸盐缓冲溶液配制质量浓度为1 mg/mL的样品溶液。仪器参数设定:激发波长为280 nm,扫描发射光谱范围为300～400 nm,激发和发射狭缝宽度均为5 nm。

1.2.7 傅里叶变换红外光谱(FTIR)测定

FTIR测定参考许英一等[11]的方法。称取2 mg的样品,加入0.2 g溴化钾,研磨均匀,压成均一透明的薄片。用FTIR仪测定波数为4 000～400 cm-1的红外光谱,分辨率4 cm-1,波数精度0.01 cm-1,扫描次数32次,环境温度25 ℃。

1.2.8 溶解性测定

采用氮溶解指数法,测定方法参照文献[5]。

1.2.9 乳化性及乳化稳定性测定

采用浊度法,测定方法参照文献[5]。

1.2.10 持水性、吸油性测定

参考Jamdar等[13]的方法,稍作修改。称取0.5 g样品记为m0,置于离心管中,记录离心管和样品的总质量为m1,分别加入5 g去离子水或5 g大豆油,涡旋振荡5 min后于室温条件下静置20 min,10 000 r/min离心20 min,弃去上清液,称质量离心后样品与离心管的总质量记为m2。持水性(WHC)及吸油性(OAC)的计算如式(3)所示。

WHC或OAC=m2-m1m0

(3)

1.2.11 起泡性及泡沫稳定性的测定

参考Ma等[14]的方法,并稍作修改。称取0.5 g样品于烧杯中,加入50 mL去离子水,磁力搅拌30 min使其充分溶解。用高速剪切机以12 000 r/min均质2 min,迅速将烧杯内的液体与泡沫倒入量筒中,记录体积V1,将其静置30 min后,记录体积V2。起泡性(FC)及泡沫稳定性(FS)的计算见式(4)和式(5)。

FC=V1-5050×100%

(4)

FS=V2-50V1-50×100%

(5)

1.2.12 数据分析

2 结果与分析

2.1 超声改性对小麦麸皮蛋白氨基酸含量的影响

超声改性前后小麦麸皮蛋白的氨基酸组成分析结果如表1所示。超声改性后的小麦麸皮蛋白(UWBP)的必需氨基酸(EAA)含量、总氨基酸(TAA)含量和EAA/TAA较超声改性前蛋白(WBP)均有所提高。WBP的EAA/TAA为0.359,而UWBP的EAA/TAA均高于FAO /WHO 标准规定的0.4[15],因此超声改性后的小麦麸皮蛋白是氨基酸比例均衡的理想蛋白模式。由表1可以看出,超声预处理明显提高了蛋白质中Ala、Val、Ile、Leu、Phe、Pro等疏水氨基酸的含量,这也是超声改性提高了小麦麸皮蛋白的乳化性等功能性质的原因。Jia等[16]研究表明超声预处理可以改变蛋白的侧链结构使蛋白结构变的松散,从而暴露更多的疏水性基团,从而使疏水氨基酸比例增加。

表1 WBP、UWBP的氨基酸的组成(g/100 g 样品)

2.2 超声改性对小麦麸皮蛋白巯基和二硫键含量的影响

游离巯基对于维持蛋白质三级结构有重要作用,可参与次级键的形成,其含量能够反映蛋白质的变性程度,但是极容易被氧化成二硫键。由图1可知,超声后WBP的游离巯基含量下降,总巯基和二硫键含量均显著上升(P<0.05)。超声处理15 min的总巯基和二硫键含量最高,分别为(13.00±0.32)μmol/g和(4.94±0.12)μmol/g。游离巯基含量的下降是因为超声处理会产生过氧化氢,而巯基在过氧化氢的存在下极易被氧化[17],这与孙英杰[18]的研究结果一致。还有推测游离巯基含量下降是由于超声波作用产生大量具有高能量和高热量的空穴气泡,促进了体系中自由基的形成,诱发了蛋白的氧化,导致巯基转化为二硫键[19]。总巯基含量和二硫键含量上升可能是由于超声处理改变了蛋白质的构象,蛋白内部结构展开,内部巯基暴露,使总巯基含量上升,同时由于暴露出来的巯基被氧化或者巯基和二硫键相互转化而使二硫键含量上升。

注:小写字母不同表示差异显著(P<0.05),图2、图5～图8同。

2.3 超声改性对小麦麸皮蛋白表面疏水性的影响

蛋白质表面疏水性是表征与极性水环境接触的蛋白质表面疏水基团数目的指标,并且与其乳化性质密切相关。由图2可知,超声处理增大了WBP的表面疏水性,且随超声处理时间的延长呈先增大后减小的趋势,超声处理10 min的表面疏水性最大,达到6 788.40±112.00。这是因为超声的空化作用将埋在蛋白质内部的疏水基团和区域暴露于极性环境的数量增加,但随着超声处理时间增加,蛋白颗粒之间通过静电等非共价作用发生聚集,导致部分暴露的疏水基团又被重新包埋。这与杜琛等[20]和望运滔等[6]的研究结果一致。

图2 不同超声处理时间对WBP表面疏水性的影响

2.4 超声改性小麦麸皮蛋白的内源荧光光谱分析

超声的空化效应使蛋白质构象变化,改变了色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸基团的局部分子环境,从而使荧光光谱发生变化。由图3可知,样品的荧光强度随超声处理时间的延长呈现先升高后降低的趋势,在超声10 min 时有最大荧光强度。荧光强度的升高可能是由于超声处理使蛋白质发生伸展,内部的色氨酸残基暴露于蛋白表面,从而表现出了更强的荧光强度。李海静等[21]也认为超声处理(20 kHz,200 W,15 min)可以使海参性腺蛋白酶解物结构展开,破坏蛋白质分子的疏水键,诱导蛋白质分子内更多疏水基团暴露,从而导致荧光强度增加。随着超声时间的继续延长,荧光强度下降,这种由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起的荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。这种现象的原因可能是较长时间的超声处理会使蛋白质分子发生交联、聚集,已经暴露的色氨酸基团重新包埋于蛋白质内部,引起蛋白质空间位阻增加,导致蛋白发生荧光猝灭现象[22]。

图3 不同超声时间处理的WBP的内源荧光光谱

当激发波长为 280 nm 时,未超声蛋白的最大荧光发射波长为 355 nm;超声处理10 min蛋白的最大荧光发射波长达到 365 nm,最大吸收峰红移10 nm,红移的发生表明蛋白质舒展,导致掩埋在蛋白质内部的色氨酸残基暴露于更加亲水以及极性更大的环境中。这与王萌[23]报道的结果一致。

2.5 超声改性小麦麸皮蛋白的FTIR分析

FTIR光谱是研究氢键类型的有力手段,而蛋白质的二级结构与蛋白分子间的氢键类型密切相关。由图4可知,在红外区的9个特征吸收带中,研究蛋白质的二级结构最有价值且较为成熟的吸收带为酰胺Ⅰ带[24]。与WBP相比,超声处理后蛋白的酰胺Ⅰ带吸收峰值位置从1 658.17 cm-1分别偏移至1 657.69、1 656.69、1 657.24、1 657.13 cm-1,这说明了超声处理使蛋白结构更加稳定,氢键作用增强,使得CO等化学键的键长增大,由于化学键的伸缩振动与键长的平方根成反比,因此键长增大使伸缩振动频率减小,导致波数减小。酰胺Ⅱ带(1 500～1 600 cm-1)的峰从1 535.04 cm-1偏移至1 537.09、1 536.09、1 536.03、1 533.40 cm-1,且峰强度减弱。造成峰强变化的原因之一是蛋白质的构象变化,这是氢键和诱导效应的共同影响造成的,结合2.4内源荧光光谱分析结果,超声处理能够影响小麦麸皮蛋白分子的构象变化,对分子间空间排布和相互作用也有一定改变[25]。

图4 不同超声时间处理的WBP的FTIR光谱

2.6 超声改性对小麦麸皮蛋白溶解性的影响

蛋白质与水之间的作用力主要是蛋白质中的肽键或氨基酸的侧链同水分子之间发生了相互作用,蛋白质变性的程度也可以通过蛋白质溶解度评价。如图5可知,与未超声处理蛋白相比,超声能够显著提高WBP的溶解性(P<0.05),随着超声处理时间延长,蛋白溶解性均显著增加(P<0.05)。当超声时间为30 min时,蛋白的溶解性达到最大值(29.59±0.25)%,比未经超声处理的原蛋白溶解度(9.59±0.18)%提高了208.55%。超声的空化和机械效应可以将粒径较大的蛋白质聚集体解聚成粒径较小的蛋白质颗粒,从而降低蛋白质聚集体粒径,使蛋白质与水接触表面积增大,相互作用增强[6],随着超声时间的延长,空化和机械效应也随之增强,所以蛋白的溶解性逐渐增大。这与Hu等[26]的研究结论一致。

图5 不同超声处理时间对WBP溶解性的影响

2.7 超声改性对小麦麸皮蛋白乳化性和乳化稳定性的影响

超声波处理通过影响蛋白的氨基酸侧链活性基团和空间构象,进而调控其乳化性等功能特性。如图6可知,超声处理显著提高了蛋白的乳化性(P<0.05),乳化活性指数(EAI)随超声时间的延长而增大。当超声时间为30 min时,蛋白的EAI最高,达到(57.76±0.65)m2/g,比未超声处理蛋白高66.41%。这与此超声条件下蛋白具有最高的溶解性(图5)有关。超声处理对蛋白的乳化稳定性影响不显著(P>0.05),乳化稳定性指数(ESI)随超声时间的延长呈先增大后减小的趋势。当超声时间为10 min时,蛋白的ESI最高,达到(18.99±0.28)%,比未超声处理蛋白高14.54%。这与此超声条件下蛋白具有最高的表面疏水性(图2)有关。适当的超声处理能够使蛋白空间结构分散,蛋白质发生适度变性,内部疏水性基团暴露,增强其溶解性,蛋白分子更加柔韧,蛋白在油-水界面展开形成较稳定的网络结构和界面膜,乳化性增强。乳化稳定性随着超声时间的延长先增大后减小,可能由于超声处理时间变长,导致蛋白变性程度增大,分子聚集,不溶性蛋白含量增多,乳化稳定性减小[27]。Taha等[28]在超声改性大豆蛋白中也发现蛋白质颗粒越小,更容易快速扩散到油滴表面,通过重新排列成膜降低了界面张力,避免了油滴聚集。

图6 不同超声处理时间对WBP乳化性和乳化稳定性的影响

2.8 超声改性对小麦麸皮蛋白持水性和吸油性的影响

由图7可知,与未超声处理蛋白相比,超声处理显著提高了WBP的持水性(P<0.05),但不同超声处理时间蛋白的持水性无显著性差异(P>0.05)。当超声时间为30 min时,蛋白的持水性最高,达到(9.07±0.24)g/g,比未超声处理蛋白高140.58%。这与此超声条件下蛋白具有最高的溶解性(图5)和乳化性(图6)有关。超声处理会展开蛋白质分子的部分结构,亲水性基团逐渐暴露出来,提高了蛋白的水结合能力,持水性增大。但随着超声处理时间的延长,蛋白的变性增强,使蛋白与水的结合能力增加缓慢,甚至有所下降,因此不同超声处理时间蛋白的持水性无显著性差异[29]。这与戚亭等[30]结论一致。与未超声处理蛋白相比,超声处理显著提高了WBP的吸油性(P<0.05),但不同超声处理时间蛋白的吸油性无显著性差异(P>0.05)。随超声时间延长,蛋白吸油性呈先升高后降低的趋势,当超声时间为15 min时,蛋白吸油性最高,达到(23.96±0.36)g/g,比未超声处理蛋白高223.78%。这可能是由于超声过程中产生的空穴效应展开了蛋白结构,埋藏在内部的侧链解离,暴露出更多的非极性基团,从而提高了蛋白的吸油性,但随着超声时间的延长,蛋白质变性程度增大,吸油性随之降低。这与王忠合等[31]的研究结论一致。

图7 不同超声处理时间对WBP持水性和吸油性的影响

2.9 超声改性对小麦麸皮蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响

如图8可知,与未超声处理蛋白相比,超声处理显著提高了WBP的起泡性和泡沫稳定性(P<0.05),并随超声时间的延长呈现先增大后减小的趋势。当超声时间为15 min时,蛋白的起泡性最大,达到(130.00±4.71)%,比未超声处理蛋白高225.00%。这与此超声条件下蛋白具有最高的持油性(图7)有关。当超声时间为10 min时,蛋白的泡沫稳定性最大,达到47.06%,比未超声处理蛋白高464.95%。这与此超声条件下蛋白具有最高的乳化稳定性(图6)有关。适当的超声处理能够提高蛋白起泡性和泡沫稳定性的原因是由于超声使蛋白结构变得更加分散,折叠蛋白打开的更多,疏水基团暴露,界面张力降低。而超声30 min时起泡性减小的原因可能是长时间超声处理下的空穴效应过强,产生的机械效应和高压破环了蛋白的发泡体系,使分散的蛋白质再次聚集,将疏水基团藏于蛋白质内部,同时减弱了蛋白质多肽链之间的相互作用,降低了起泡性[32],这与许琳[33]的研究结论一致。

图8 不同超声处理时间对WBP起泡性和泡沫稳定性的影响

3 结论

采用不同超声处理时间对小麦麸皮蛋白分散液进行处理,与未超声处理蛋白相比,超声处理使蛋白的总巯基含量、二硫键含量、表面疏水性升高,蛋白内源荧光强度增大,但使蛋白游离巯基含量降低。通过内源荧光光谱和傅里叶变换红外光谱分析表明超声处理影响了WBP分子的构象变化,对分子间空间排布和相互作用也有一定改变。与未超声处理相比,超声处理显著提高(P<0.05)了WBP的溶解性、乳化性、持水性、吸油性、起泡性和泡沫稳定性。说明适度的超声处理使蛋白结构展开,内部疏水性基团暴露,增强了蛋白的溶解性、乳化性等功能特性。因此,适度超声处理对扩大小麦麸皮蛋白作为一种重要功能成分在食品工业中的应用具有重要的价值。