蜂花粉中新烟碱农药的残留分析及膳食摄入风险评估

石会娟，张敏，张金振，黄京平，赵文，王鹏，胡菡，薛晓锋，金玥

（中国农业科学院蜜蜂研究所，农业农村部蜂产品质量监督检验测试中心（北京），北京 100193）

蜂花粉是工蜂采集花粉，用唾液和花蜜混合后形成的物质[1]，含有多种氨基酸、ω-3脂肪酸、复合维生素B、矿物质和多酚等物质，具有丰富的营养价值[2]，被认为是人类营养的宝库[3]。有研究表明蜂花粉具有抗氧化[4]、抗菌[5]、抗炎[6]、抗癌[7]、保肝[8,9]、保护心脏[10]、抗过敏活性和抑制免疫反应[11]的作用，常作为天然膳食补充剂[12-14]。然而，由于特殊的生产方式和暴露的生产环境，蜂花粉极易吸附环境中的污染物，常作为环境指示剂[2]。同时，蜜源植物种植过程施用农药也会造成蜂花粉污染物残留，危害食用者健康[15]。

新烟碱农药是目前使用最广泛的杀虫剂[16]。这主要得益于其对哺乳动物低毒的特性。然而，已有报道指出新烟碱农药的过度使用和长期积累，会对哺乳动物产生慢性、累积毒性[17]，导致生育能力下降[18]，发育迟缓[19]，运动活性降低[20]，染色体畸变率增加[21]，诱发乳腺癌[22]等疾病。目前我国登记使用的新烟碱农药共10种，包括吡虫啉、噻虫嗪、啶虫脒、噻虫胺、噻虫啉、呋虫胺、烯啶虫胺、氯噻啉、哌虫啶和环氧虫啶，其中前8种使用较广泛，涉及作物50余种。新烟碱农药具有良好的渗透性和内吸传导性，能够从土壤、种子、水源迁移至植物花粉和花蜜中，经蜜蜂采集污染蜂产品[23]。

Tang等[24]、Wen等[25]和Xiao等[26]均在蜂花粉中检出多种新烟碱农药。欧盟SANTE/11278/2021规定了啶虫脒、吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺在蜂产品中的最大残留限量（MRLs）为50 ng/g，噻虫啉为200 ng/g[27]；日本规定啶虫脒在蜂产品中的MRL为200 ng/g[28]；目前我国《GB 2763-2021食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[29]规定了新烟碱农药在主要粮食作物和果蔬中的MRLs为10～2000 ng/g，而未在蜂产品中规定其限量。因此，开展我国多地区、多种蜂花粉中新烟碱农药的残留分析及其膳食摄入风险评估，具有十分重要的意义。

本研究利用QuEChERS前处理方法结合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法分析了我国主要养蜂区的66批次蜂花粉样品中8种常用新烟碱农药的残留情况，并根据残留浓度、膳食结构和毒理学数据进行膳食摄入风险评估，可为新烟碱农药在蜜粉源植物生长过程中的科学使用，以及在蜂花粉中MRLs的制定提供理论依据和数据支持。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

1290-6495 高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪，美国Agilent公司；天平（十万分之一天平，百分之一天平），梅特勒-托利多（上海）；TTL-DC Ⅱ水浴氮吹仪，中国同泰联公司；CR22GⅡ高速离心机，日本日立；Vortex-Genie2涡旋混合器，美国Scientific Industries；Integral5 Mili-Q去离子水发生器，美国Mili-Q。

乙腈、甲醇（色谱级），德国Merck公司；柠檬酸钠、柠檬酸二钠倍半水合物、无水硫酸镁、氯化钠、十八烷基硅烷键合硅胶（C18，40～60 μm）、乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA，40～60 μm）、石墨化碳黑（GCB，40～ 60 μm），均购于美国Agilent公司；甲酸（色谱纯），美国Fisher Scientific；吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、噻虫胺、噻虫啉、呋虫胺、氯噻啉、吡虫啉-d4、啶虫脒-d3、噻虫嗪-d3、呋虫胺-d4（纯度均≥98%），天津阿尔塔公司。

1.2 样品采集

于2022年，在河南、四川、江苏、甘肃、湖北、山东6个主要养蜂区分别采集16、12、9、9、6、5批次，以及其他地区9批次（安徽2批次，广东、青海、浙江、山西、吉林、内蒙古、江西各1批次）；采集样品包括油菜花粉28批次，茶花粉17批次，荞麦花粉10批次，杂花粉7批次，其他花粉4批次（荷花花粉2批次，蚕豆和玉米花粉各1批次）共计采集蜂花粉样品66批次，每份样品500 g，置于样品瓶中密封，4 ℃条件下保存，备用。

1.3 样品前处理

参考宋梓豪[30]所开发的QuEChERS前处理方法：准确称取2 g（精确至0.01 g）蜂花粉样品于50 mL塑料离心管中，加入10 mL水涡旋混匀1 min，加入10 mL乙腈涡旋混匀1 min。加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸二钠倍半水合物，剧烈振荡并涡旋10 min，于4 ℃，9000 r/min离心10 min。准确移取7 mL上清液于含有1200 mg硫酸镁、400 mg PSA、400 mg C18和45 mg GCB的15 mL离心管中。涡旋混匀10 min，于4 ℃，9000 r/min离心10 min。吸取1 mL上清液，于40 ℃水浴氮气吹干，1 mLφ=20%乙腈水溶液复溶，过0.22 μm微孔滤膜待液相色谱-串联质谱测定。

1.4 仪器测定条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：A为φ=0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；流动相梯度洗脱：0～4 min，20% A～60% A；4～4.1 min，60% A～100% A；4.1～6 min，100% A～100 %A；6～6.1 min，100% A～20% A；6.1～9.5 min，20% A。柱温：40 ℃；进样量：3 μL；电离方式：电喷雾电离；扫描方式：正离子扫描，MRM模式；雾化气：氮气；雾化气压力：310 kPa；离子喷雾电压：3500 V；干燥器温度：250 ℃；干燥气流速：7 L/min；离子监测条件参照宋梓豪[30]一文。

1.5 膳食摄入风险评估

膳食摄入风险评估是以毒理学和残留化学评估为基础，根据我国居民膳食消费量，估算农药的膳食摄入量，计算膳食摄入风险，包括长期和短期膳食摄入风险。参考我国《食品中农药残留风险评估指南》（中华人民共和国农业部，2015）第三章，对本研究中来自蜂花粉样品的新烟碱农药残留进行膳食风险评估。

估算蜂花粉长期日均摄入量（National Estimated Daily Intake，NEDI）和短期摄入量（National Estimated Short Term Intake，NESTI），计算公式如下：

式中：

C——长期日均摄入量（NEDI），g；

D——短期摄入量（NESTI），g；

Z——蜂花粉中新烟碱农药的残留浓度中值（STMR），ng/g；

F1——长期食用蜂花粉人群的日均消费量，取20 g/d；

E——蜂花粉中新烟碱农药的最高残留浓度（HR），ng/g；

F2——短期内单次或多次食用蜂花粉的日摄入量，取40 g/d。

计算膳食摄入长期风险（RQ1，%）和短期风险（RQ2，%），计算公式如下：

式中：

Q1——长期风险（RQ1），%；

Q2——短期风险（RQ2），%；

A——每日允许摄入量（Acceptable Daily Intake，ADI），来源于GB 2763-2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[29]mg/(kg bw·d)；

B——急性参考剂量（Acute Reference Dose，ARfD），来源于英国赫特福德大学农药特性数据库[31]，mg/(kg bw·d)；

bw——体质量，本研究中取60 kg。

计算各新烟碱农药的膳食摄入风险商，评估风险值大小。RQ值越小风险越小，当某种农药在蜂花粉中的残留水平导致RQ1＞100%时，表示居民长期摄食该蜂花粉可能带来不可接受的健康风险；当某种农药残留导致RQ2＞100%时，表示偶尔、短期摄入该蜂花粉也可能造成健康危害。

1.6 数据处理与分析

使用SPSS 26.0和Excel完成数据计算，Origin完成图形绘制。

2 结果与讨论

2.1 检出限、定量限、线性范围、回收率及精密度

本研究中8种新烟碱农药的检出限为0.3 ng/g，定量限为1.0 ng/g，分别以3倍和10倍信噪比计算获得。在0.15～50 μg/L范围内具有较好的线性相关性，其相关系数均大于0.999。对空白蜂花粉样品进行加标回收实验，加标的水平分别为1、2、10、50 ng/g，制备6份，按上述方法连续三天进行测定，考察精密度。结果表明分析物的平均回收率在83.1%～119%之间，日内和日间相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）均小于16.1%。实验证明，本实验方法的定性、定量分析、线性关系、回收率能够保证检测结果的准确性和再现性。

2.2 蜂花粉中新烟碱农药的残留水平

2.2.1 蜂花粉中新烟碱农药残留的总体情况

如表1所示，在66批次蜂花粉样品中，共检出5种新烟碱农药，检出率最高的是噻虫嗪（31.8%），其次是吡虫啉（22.7%）、噻虫胺（19.7%），啶虫脒（16.7%）、检出率最低的是呋虫胺（12.1%）。平均残留浓度从高到低依次是啶虫脒（20.1 ng/g）、呋虫胺（9.2 ng/g）、吡虫啉（8.3 ng/g）、噻虫嗪（8.1 ng/g）和噻虫胺（1.8 ng/g）。检出浓度最高的是啶虫脒（195.1 ng/g），其次是吡虫啉（59.9 ng/g），仅啶虫脒和吡虫啉的最大残留浓度超过了欧盟规定的MRLs（50 ng/g）[27]。除啶虫脒检出浓度较高外，其余几种新烟碱农药的检出浓度范围与Colding等[32]报道的结果相似。啶虫脒是我国主要使用的新烟碱农药之一，已在我国蜂蜜、蜂花粉和蜂粮样品中检出，在Wang等[33]的研究中啶虫脒是我国蜂蜜中检出率最高的新烟碱农药。蜂花粉中啶虫脒的高残留率和残留浓度，与其在我国农作物上广泛施用有关。

表1 蜂花粉样品中新烟碱农药的残留情况Table 1 The detection rate and residue concentration of neonicotinoids in different bee pollen samples

50.0 %的蜂花粉样品中检出一种及以上的新烟碱农药，检出率与Tao等[24]和Wen等[25]的在我国油菜花粉中的检出结果相似，低于Mitchell等[34]报道的蜂蜜样品中新烟碱农药的检出率。检出1种药物的样品占比16.7%，检出多种药物残留的样品占比33.3%（其中检出2种农药的占21.2%，检出3种的占4.6%，检出4种的占7.6%）。茶花粉中新烟碱农药的检出率最高，达82.4%，其次为油菜花粉（50.0%）、杂花粉（28.6%）和荞麦粉（20.0%）。除荞麦花粉外，其余蜂花粉样品中均存在多种药物残留现象，多残留比例在茶花粉、杂花粉和油菜花粉中分别为64.6%、28.6%和25.0%，并且只在茶花粉中同时检出3～4种新烟碱农药（图1）。结果表明，我国蜂花粉中新烟碱农药呈现多残留特征，说明在蜜粉源植物种植期有多种药物混合施用的现象。检出的33批次蜂花粉样品中，平均残留浓度从高到低依次是杂花粉（102.3 ng/g）、荞麦粉（31.5 ng/g）、茶花粉（14.8 ng/g）、油菜花粉（9.1 ng/g）和其他花粉（5.5 ng/g）。蜂花粉样品中新烟碱农药的最高残留浓度为200.7 ng/g（杂花粉），其次为59.9 ng/g（荞麦粉）。所有阳性样品中新烟碱农药的平均检出浓度为18.9 ng/g，中位检出浓度9.8 ng/g，残留浓度的中位值均不高于平均值，这表明蜂花粉样品中的新烟碱农药主要是低浓度残留。

图1 不同植物源蜂花粉中新烟碱农药的检出率Fig.1 The detection rate of neonicotinoids in different bee pollen samples

2.2.2 新烟碱农药在不同植物源蜂花粉样品中的残留情况

通过对不同植物源花粉样品中新烟碱农药的残留特征的统计分析，经卡方检验分析表明茶花粉中新烟碱农药的检出率，显著高于油菜花粉、杂花粉和荞麦花粉；并且茶花粉的多残留比例，也显著高于其他三种花粉（P＜0.05）。在我国吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪和呋虫胺等新烟碱农药已登记用于茶树防治茶小绿叶蝉等虫害。在茶树种植期间，预防性用药，以及高频率和多种药物混合施用，是导致茶花粉中新烟碱农药多残留和高残留率的主要原因。同时值得注意的是，新烟碱农药中仅噻虫嗪登记用于油菜的蚜虫等病虫害防治，但在油菜花粉中，检出4种新烟碱农药，说明在油菜种植期存在混用、滥用以及外界环境污染现象。

检出的33批次蜂花粉样品中，杂花粉中新烟碱农药的总平均检出浓度（102.3 ng/g）以及啶虫脒平均残留浓度（98.4 ng/g），均显著高于茶花粉（14.8 ng/g，2.6 ng/g）和油菜花粉（9.1 ng/g，3.1 ng/g）（t检验，P＜0.05）。杂花粉的高浓度残留，主要来自于甘肃单一样品的高浓度检出，这可能与单一地区或单一种植区域农药大量施用有关。

2.2.3 不同地区蜂花粉样品中新烟碱农药的残留情况

如图2所示，不同地区的蜂花粉样品中新烟碱农药的残留情况有较大差异，其中来自甘肃省的蜂花粉样品检出率和残留浓度均高于其他省份。检出率从高到低依次是甘肃省（77.8%）、江苏省（55.6%）、河南省（43.8%）、山东省（40.0%）、四川省（33.3%）和湖北省（16.7%）；平均检出浓度从高到低依次是甘肃省（54.3 ng/g）、山东省（21.4 ng/g）、河南省（15.4 ng/g）、江苏省（8.5 ng/g）、四川省（8.2 ng/g）和湖北省（5.5 ng/g）。甘肃地区的新烟碱农药主要来自于该地区的杂花粉样品，而江苏地区阳性样品均为茶花粉。这说明新烟碱农药残留区域性差异可能与不同地区作物种类、种植方式（轮作）、农药施用情况和施药方式有关。

图2 不同地区蜂花粉样品中新烟碱农药的残留情况Fig.2 The different residue of neonicotinoids in bee pollen samples of different provinces

2.3 蜂花粉中新烟碱农药的膳食摄入风险

近年来，风险评估已广泛应用于人类膳食中农药残留的暴露风险，为保障农产品安全提供了理论依据[33]。通过计算RQ值来反映蜂花粉样品中新烟碱农药残留的膳食风险，分别取残留浓度的中位值和最大值计算其长期膳食风险值和短期膳食风险值，结果见表2。蜂花粉样品中5种新烟碱农药的长期膳食风险值（RQ1）在0.0006%～0.0021%之间，短期膳食风险值（RQ2）在0.0021%～0.1858%之间，均远低于1%，啶虫脒的RQ2最高，为0.1858%。与谭阳等[15]对蜂蜜中农药残留风险评估的结果相近，均远低于100%的判定标准，说明蜂花粉中的新烟碱农药残留风险较低，可以接受。

表2 蜂花粉中新烟碱农药残留的膳食摄入风险评估Table 2 The dietary risk assessment of neonicotinoids residues in bee pollen samples

膳食风险评估结果显示本研究中66批次蜂花粉样品中新烟碱农药的残留风险均可接受，仅有2批次样品中的新烟碱农药残留浓度超过欧盟规定的MRLs，但均低于日本MRL，整体残留浓度较低。由于国内外蜂花粉植物源存在一定差异，且膳食结构不同，因此可以参照欧盟和日本等国的MRLs，并结合我国蜜粉源作物种植期间新烟碱农药田间施用量，以及主要人群膳食摄入蜂花粉情况，研制我国蜂产品中的新烟碱农药的MRLs。

农药残留的风险评估过程中常存在一些不确定因素影响结果，导致无法完全依据现实情况测定风险，如蜂花粉一般作为冲调食品稀释饮用，实际食用的农药浓度比蜂花粉中的残留浓度要低；本研究中采用的蜂花粉日均摄入量可能与居民实际食用量存在一定差异，同时蜂花粉样品中存在新烟碱农药多残留的情况，需要进一步研究多残留农药之间的毒性作用是否存在协同或拮抗。

3 结论

在检测的66个蜂花粉样品中，50.0%的样品检出新烟碱农药残留，样品最高检出浓度200.7 ng/g，啶虫脒和吡虫啉的最高检出浓度超出欧盟的最高限量标准。不同植物来源和地理来源的蜂花粉样品间，新烟碱农药的残留水平存在一定差异，这可能与新烟碱农药的农业施用行为有关。蜂花粉中新烟碱农药残留的长期膳食和短期膳食摄入风险的评估结果均为低风险，在可接受范围内。本研究发现蜂花粉样品中普遍存在多种药物残留的现象，但累积风险和协同作用尚不清楚，需要进一步研究。