豇豆中灭蝇胺残留分析与膳食风险评估

黄健祥，谢书越，唐雪妹，黄聪灵，万凯

（广东省农业科学院农业质量标准与监测技术研究所，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（广州），国家农业检测基准实验室（农药残留），广东广州 510640）

豇豆俗称豆角、长豆角，是一类涉及千家万户、量大面广的食用农产品，在丰富人们菜篮子方面起着重要的作用[1,2]。豇豆在广东省多个地区均有广泛种植[3,4]，属于连续采摘的蔬菜且病虫害频发，在华南地区湿热气候下尤其严重[5]。日常管理耗费的人力成本高，依赖农药防控比较普遍，其质量安全情况长期备受关注[6,7]。但化学防治目前仍然是最方便、最稳定、最有效、最可靠、最经济的防治方法[8,9]。滥用、乱用、不遵守安全间隔期、使用高毒禁用农药等不科学不规范的使用行为，可能会导致豇豆中农药残留超标、食用风险过高等问题[10]，如2010年海南的豇豆质量安全事件就一度引发了消费者恐慌[11]。近年来，豇豆中农药残留仍是频频出现问题的农产品质量安全软肋之一[12]。灭蝇胺（用作兽药时称为环丙氨嗪）化学名N-环丙基-1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺，是一种新型的三嗪类昆虫生长调节剂[13]，能干扰双翅目幼虫和蛹在发育过程中的正常生长从而防治虫害[14,15]；也可用在养殖业上用以控制苍蝇[16,17]。灭蝇胺常用来防治豇豆生长过程中的虫害美洲斑潜蝇（俗名“鬼画符”，图1）。它具有内吸性，在植物体内有较强的传导性；施到土壤中由根系吸收、向顶传导[18]。灭蝇胺在豇豆生产中大量被使用，有时会造成农药残留超标问题[19]。与此同时，灭蝇胺在豇豆上未登记，缺乏科学的用药指引，需要重点关注。因此，有必要开发一种简便、快速、准确的分析方法，为豇豆的质量安全监测提供高效的技术支撑。

图1 美洲斑潜蝇危害的豇豆叶片Fig.1 Cowpea leaves damaged by Liriomyza sativae Blanchard

灭蝇胺极性比较强，可溶于水，多农残的前处理方法往往不能很好地将其提取，影响回收率[20]。目前，灭蝇胺分析中常见的前处理技术有固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）[21-23]、分散固相微萃取（Dispersive Micro Solid Phase Extraction，DMSPE）[24]、QuEChERS法（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）[25]等，检测以液相法[26]、液相-串联质谱法[27,28]为主。液相法灵敏度较低且容易受到干扰，所需的前处理过程往往比较繁琐费时[29]；液相色谱-质谱法抗干扰性强、灵敏度高、通量高，常见挑战是灭蝇胺的回收率低和样品的基质效应。为了保证结果的准确性，研究者尝试了同位素内标法、加水提取后定容[30]、加酸提取[31,32]等方法。本研究建立了一种基于QuEChERS-液相色谱-串联质谱仪（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）的豇豆中灭蝇胺高效分析方法。优化了提取溶剂等条件，在乙腈中加入φ=15%的乙酸提升灭蝇胺的提取率；使用基质匹配标准溶液进行定量，降低豇豆样品基质效应的影响；对方法进行了确认并应用于实际样品的分析；进行膳食暴露风险评估，探明豇豆中灭蝇胺的食用风险；研究灭蝇胺残留在豇豆中的降解动态，为风险评估和预警提供技术支撑和基础数据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LCMS-8060液相色谱-串联质谱仪，日本岛津公司；SiO-6512 QuEChERS自动样品制备系统，浙江本立科技股份有限公司；Multi Reax高速涡旋仪，德国Heidolph公司；高速离心机，德国Eppendorf公司；Milli-Q超纯水仪，Merk Millipore公司。

1000 mg/L灭蝇胺标准溶液（纯度≥99.5%），农业农村部环境保护科研监测所；乙腈、甲醇，色谱纯，德国Merck公司；甲酸（纯度99%），冰乙酸（纯度99%），甲酸铵（纯度≥99.0%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；NaCl、无水MgSO4，分析纯，广州化学试剂厂；PSA吸附剂（40～60 μm），GCB吸附剂（40～120 μm），天津博纳艾杰尔科技有限公司；尼龙66滤膜（0.22 μm），天津津滕公司。

112份豇豆鲜样来源于本地流通市场，覆盖农贸市场、超市、连锁生鲜店、流动小摊档等各类场所。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

称取10.00 g样品于50 mL塑料离心管中，加入10.00 mL乙腈（含体积分数15%的乙酸）、1.0 g NaCl、4.0 g无水MgSO4和5颗陶瓷均质子，使用振荡离心一体化装置在1000 r/min下振荡2 min后以4500 r/min离心5 min；吸取上清液5.00 mL于15 mL塑料离心管中，管中加入15 mg GCB、150 mg PSA和835 mg无水MgSO4，涡旋振荡1 min后以4500 r/min离心5 min；取1 mL上清液过0.22 μm尼龙滤膜，LC-MS/MS检测。

1.2.2 标准溶液配制与基质效应

准确量取适量灭蝇胺的标准储备溶液，以空白样品提取液稀释成0.005、0.010、0.050、0.10、0.50和1.00 mg/L基质匹配标准溶液。同时以乙腈（含体积分数15%的乙酸）稀释配置溶剂标准溶液。基质效应（Matrix Effect，ME），计算公式如下：

式中：

E——基质效应（ME）；

Sm——基质匹配标准曲线的斜率；

Ss——溶剂标准曲线的斜率。

当ME为-20%～20%时，可以忽略。

1.2.3 LC-MS/MS检测条件

1.2.3.1 液相色谱条件

色谱柱：岛津Shim-pack XR-ODS III（50 mm×2.0 mm，1.6 μm）；流动相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B）；流速：0.4 mL/min；进样体积：1 μL；柱温：40 ℃。色谱梯度洗脱程序：0～2.5 min，5%～30% B；2.5～2.6 min，30%～5% B；2.6～4 min，5% B。

1.2.3.2 质谱条件

雾化气：3.0 L/min，干燥气：10 L/min，加热气：10 L/min；离子源接口温度：300 ℃，加热块温度：400 ℃，脱溶剂温度：250 ℃；采用ESI离子源，正源扫描多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式。灭蝇胺的质谱检测参数如表1所示。

表1 灭蝇胺的质谱检测参数Table 1 Mass spectrometry parameters for the detection of cyromazine

1.2.4 添加回收试验

称取10.00 g样品于50 mL塑料离心管中，加入适量灭蝇胺标准溶液，振荡、涡旋混匀后在4 ℃下静置15 h。添加浓度为0.010、0.10、0.50和1.00 mg/kg。

1.2.5 膳食暴露风险评估

我国规定豇豆中灭蝇胺的最大残留限量（Maximum Residue Limit，MRL）为0.5 mg/kg[33]。同时使用膳食摄入风险评估方法进行评价，豇豆中灭蝇胺残留的长期摄入风险以风险熵（Risk Quotient，RQ）表示。风险熵RQ（%）采用下列公式计算[34,35]：

式中：

E——估算每日摄入量（National Estimated Daily Intake，NEDI），mg/(kg·d)；

Q——风险熵（Risk Quotient，RQ），%；

Ci——豇豆样品中灭蝇胺的阳性样品检出平均值或灭蝇胺在我国已登记作物上的MRL，mg/kg；

Fi——一般人群对该种食物的摄入量[35]，kg·person-1·d-1；

bw——取值63 kg·person-1[36]；

A——每日允许摄入量[33]，（Acceptable Daily Intake，ADI），mg/(kg·d)。

当国家估算每日摄入量（National Estimated Daily Intake，NEDI）低于每日允许摄入量时，可认为灭蝇胺残留产生的健康风险可以接受。即RQ越小，风险越低。

1.2.6 灭蝇胺在豇豆中的消解动态试验

选取检出残留值高于灭蝇胺MRL 0.5 mg/kg的市场豇豆匀浆样品，分别在室温（约20 ℃）和4 ℃下保存（模拟家庭储藏温度条件），按0、1、2、3、5、7 d时间点进行取样检测，分析储存温度、储存时间对灭蝇胺残留量的影响及其动态变化规律。

1.3 数据处理

通过Excel 2007进行数据处理，通过Origin 8.6和Excel 2007进行绘图。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

前处理条件的优化以添加灭蝇胺浓度为0.10 mg/kg的豇豆样品为考察对象（n=3）。初始条件为：加入10.00 mL乙腈、1.0 g NaCl、4.0 g无水MgSO4和5颗陶瓷均质子；使用振荡离心一体化装置在1000 r/min下振荡2 min后以4500 r/min离心5 min；吸取上清液5.00 mL于15 mL试管中，试管中加入15 mg GCB、150 mg PSA和835 mg无水MgSO4，涡旋振荡1 min后以4500 r/min离心5 min；取1 mL上清液过0.22 μm尼龙滤膜，LC-MS/MS检测，基质匹配标准溶液定量。测得回收率为48.1%，未满足农药残留分析的要求。

2.1.1 提取时间

使用振荡离心一体化装置，将提取时间由2 min分别增加为3、4和5 min，考察灭蝇胺回收率的变化。结果显示，回收率分别为46.7%、47.6%和46.0%，提取时间的增加未能改善方法准确度低的问题。

2.1.2 涡旋和离心装置

固定其它条件，将前处理初始条件里的提取装置改为高速涡旋仪器，提取和净化涡旋时均使用10000 r/min，灭蝇胺回收率为52.2%；固定其它条件，将前处理初始条件里的离心装置改为高速离心装置，提取和净化离心时均使用10000 r/min，回收率为42.3%。结果表明，提高前处理过程中涡旋或者离心净化的强度均未能改善方法准确度低的问题。

2.1.3 提取溶剂

灭蝇胺为强极性物质，水溶性较好，在有机提取溶剂里加入酸有利于从样品中提取灭蝇胺。在乙腈中添加乙酸，体积分数分别为1%、2%、5%、10%、15%、20%和25%，考察了不同体积分数乙酸对提取灭蝇胺效果的影响。结果如图2所示，随着提取溶剂乙腈中乙酸的增加，灭蝇胺回收率逐渐增高；当乙酸体分数增加到15%以上时，回收率无明显的变化。最终选择含φ=15%乙酸的乙腈为提取溶剂。

图2 乙酸体积分数对灭蝇胺回收率的影响Fig.2 Effect of volume fraction of acetic acid on recovery of cyromazine

2.2 方法确认

根据1.2.2节的方法计算得到ME值＜-20%，基质抑制效应较强，不能忽略。推测是因为提取溶剂中含有较大比例的乙酸，在提升对灭蝇胺提取效果的同时也增加了杂质。为进行准确的定量分析，本研究采用基质匹配标准溶液进行校正。

称取空白豇豆样品，经过仪器分析确定其灭蝇胺残留量低于检出限后，以空白样品提取液配制0.005、0.010、0.050、0.10、0.50、1.00 mg/L的基质匹配标准工作溶液。以基质标样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归得到工作曲线。以0.005 mg/L标准溶液的定量离子色谱峰考察信噪比，按3倍信噪比计算检出限（Limit of Detection，LOD）；定量限（Limit of Quantitation，LOQ）为最低添加浓度0.010 mg/kg，灵敏度高于韩永涛等[23]、田培等[32]的报道；与张锋锋等[13]的菜豆中灭蝇胺检测方法相当。在空白样品中添加不同浓度的标样，每个添加量重复5次，结果显示豇豆中灭蝇胺的回收率为76.2%～82.8%，相对标准偏差（Relative Standard Deviations，RSDs）为1.0%～5.7%，符合农药残留分析的要求[37]。豇豆中灭蝇胺的工作曲线、检出限、定量限和回收率详见表2，色谱图如图3所示。

表2 豇豆中灭蝇胺的线性方程、相关系数、检出限、定量限及回收率Table 2 Linear equation, correlation coefficient, LOD and recoveries of cyromazine in cowpea

图3 豇豆样品中灭蝇胺的提取离子流色谱图.Fig.3 Extraction ion chromatogram of cyromazine in cowpea sample

2.3 市场样品分析与膳食暴露风险评估

应用本方法对市场流通样品进行灭蝇胺的残留分析，结果显示，灭蝇胺检出25次，检出比例22.3%；检出值范围为0.042～0.89 mg/kg，25个阳性样品的检出平均值为0.32 mg/kg；超标5次，超标比例4.5%，其中超市、农贸市场（含连锁生鲜店）和流动小摊档分别超标1、1和3次。

我国已登记灭蝇胺的食用性作物有菜豆、大葱、黄瓜、姜、韭菜和平菇[38]。根据农业部的膳食风险评估模板[35]，韭菜的风险评估食物归类深色蔬菜；豇豆、菜豆、黄瓜归类为浅色蔬菜；平菇归类为水果（参考“蘑菇”）；大葱、姜归类为酱油。参考限量优先选择我国的MRL，其次是国际食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission，CAC）。如果我国和CAC均没有适合参考的MRL，依次从美国、澳大利亚、韩国、欧盟、日本、新西兰等国家或国际组织发布的标准中选择适合的限量作为评估依据。所查询的国家、组织均未制定韭菜上灭蝇胺MRL，采用我国国标中同为绿叶葱类作物的葱的MRL 3 mg/kg为参考限量。根据1.2.5节中的公式计算得到普通人群灭蝇胺的NEDI为0.406 mg，占ADI的10.74%，表明通常不会对一般人群健康发生不可接受的风险[39]，如表3所示。

表3 灭蝇胺的膳食风险评估Table 3 Dietary risk assessment of cyromazine

2.4 豇豆中灭蝇胺残留的动态变化

农药半衰期差异性的影响因素包括温度、湿度、光照、食品种类等。不同储存温度下豇豆中灭蝇胺残留的消解动态结果如图4所示。初始浓度为0.74 mg/kg，随着存放时间的增加，灭蝇胺残留值逐渐降低。室温样品、冷藏样品分别在第2、3天时，灭蝇胺残留值低于MRL 0.5 mg/kg，说明较高的温度有利于灭蝇胺残留的降解。灭蝇胺在豇豆样品中的残留消解动态规律符合一级动力学方程，室温和冷藏条件下的消解半衰期分别为5.0和7.2 d。Fu等[14]的研究显示田间条件下灭蝇胺在豇豆中的半衰期分别为4.65 d（单剂）和3.87 d（混剂）；张锋锋等[13]分析了灭蝇胺在菜豆上的消解动态与最终残留，半衰期为3.2～6.1 d。本研究与文献报道的灭蝇胺半衰期结果相近。

图4 灭蝇胺在豇豆中的残留消解动态Fig.4 Dissipation dynamics of cyromazine residue in cowpea

3 结论

本文采用QuEChERS-液相色谱-串联质谱法分析豇豆中的灭蝇胺，通过增加提取溶剂里乙酸的含量提升对灭蝇胺的提取效率，改善了水溶性农药灭蝇胺在分析中回收率偏低的问题。方法简便、快速、准确，LOD为0.001 mg/kg，LOQ为0.010 mg/kg，4个添加水平的回收率为76.2%～82.8%，RSD为1.0%～5.7%。

应用所建立的灭蝇胺分析方法，评估了本地市场112个豇豆样品中灭蝇胺的残留情况。结果表明，灭蝇胺的检出值为0.042～0.89 mg/kg，检出比例为22.3%，超标比例为4.5%。基于灭蝇胺在我国农作物上的登记使用情况、市场样品分析结果和我国居民的膳食数据，对灭蝇胺进行长期膳食摄入风险评估。结果表明，灭蝇胺的膳食摄入RQ为10.74%，不会对一般人群健康造成不可接受的风险。但部分样品存在超标问题，应给予重视。存放温度、存放时间均对豇豆中灭蝇胺的残留变化有影响，较高的温度有利于残留值降低。从产地调研和市场样品分析的结果来看，灭蝇胺在豇豆生产中有比较强的必要性和实用性，应鼓励灭蝇胺在豇豆上进行登记，解决其使用的合法性问题，为种植者提供科学安全使用规范。同时宣传普及使用已登记的农药乙基多杀菌素或溴氰虫酰胺防治豇豆上的美洲斑潜蝇。