METTL5对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响及机制

彭修法,王蕊红,王晔,刘凤娟,张春玲

(青岛大学附属青岛市中心医院,山东 青岛 266042 1 呼吸与危重症医学科; 2 检验科)

2021年的统计数据显示,肺癌位居全球癌症相关死因之首,每年因肺癌死亡的人数达180万,我国每年肺癌新发及死亡病人分别占全球的37.0%和39.8%[1-2]。肺癌主要分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌两种类型,其中NSCLC占总数的85%左右,NSCLC中又以肺腺癌最常见[3]。除常规的放疗、化疗以及手术治疗等手段外,近年来靶向及免疫治疗获得长足发展,使肺腺癌病人生存有了明显改善,但晚期病人5年总生存率仍不足20%[4]。因此,仍需继续探究肺腺癌发病机制,寻找新的治疗靶点。据报道,近来作为研究热点的m6A转录后修饰在肿瘤发生发展中发挥重要作用[5-7]。我们前期生物信息学研究发现,m6A相关修饰酶甲基转移酶样蛋白5(METTL5)在肺腺癌组织中高表达,并且其表达水平与病人总生存率呈负相关。本研究旨在进一步研究METTL5在肺腺癌中的可能作用,探讨METTL5对肺腺癌细胞迁移、侵袭的影响及相关机制,从而为肺腺癌治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

肺腺癌A549和H1975细胞系均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。无血清1640培养液(RPMI-1640)购自Gibco公司;胎牛血清(FBS)购自Excell公司;磷酸盐缓冲液(PBS)购自索莱宝公司;青链霉素混合液、2.5 g/L胰蛋白酶溶液购自Hyclone公司;一步冻存液购自海星公司;2×蛋白上样缓冲液(2×loading buffer)、电泳转移缓冲液(即转膜液)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液、TBST缓冲液购自Solarbio公司;40 g/L多聚甲醛固定液、结晶紫染液购自碧云天公司;Matrigel基质胶购自美国Corning公司;Anti-human METTL5多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG购自武汉爱博泰克公司;兔抗人E-Cadherin、Vimentin、GAPDH抗体购自美国Cell Signaling Technology公司;METTL5的干扰慢病毒购自上海吉玛公司。

1.2 实验方法

1.2.1生物信息学分析 首先在基因表达数据集(GEO)数据库中搜索肺腺癌数据,下载数据集,分析METTL5的表达情况。利用GEPIA软件根据METTL5的表达差异对肺腺癌病人进行生存分析,绘制Kaplan-Meier生存曲线。

1.2.2细胞培养、转染及稳转株筛选 A549及H1975细胞系使用RPMI-1640完全培养液(内含体积分数0.10 FBS和体积分数0.01的青链霉素双抗)培养,培养箱条件为37 ℃、内含体积分数0.05的CO2。当细胞汇合度达到90%左右并处于对数生长期时,消化并重悬两种细胞后接种于6孔板中,分别使用Control及LV3-METTL5-shRNA干扰慢病毒按照说明书进行转染,分为Control组及shMETTL5组,72 h后通过荧光显微镜观察荧光。重新铺板,加入嘌呤霉素使终质量浓度为5 mg/L,筛选METTL5敲低的稳转株。

1.2.3Western blot法检测 取经嘌呤霉素筛选后、镜下可见荧光的两组细胞,使用蛋白裂解液2×loading buffer裂解细胞提取蛋白样品,并在95 ℃条件下金属浴10 min使蛋白变性。吸取8 μL的样品加入上样孔中,140 V电泳60 min,200 mA转膜90 min,用50 g/L脱脂牛奶进行封闭。1 h后以TBST清洗PVDF膜3次,分别与一抗Anti-human METTL5多克隆抗体(1∶1 000)和Anti-human GAPDH单克隆抗体(1∶2 000)室温孵育2 h。用TBST清洗3次后将PVDF膜放于HRP标记的Anti-rabbit IgG二抗(1∶2 000)中孵育1 h。以TBST清洗后使用超敏发光液进行显影。

1.2.4TranswellTM实验检测 在检测迁移能力时,将处于对数生长期的Control组、shMETTL5组A549和H1975细胞消化并离心重悬,计数并将细胞密度调至1×108/L,向上室中每孔加入200 μL细胞悬液,并在下室中加入800 μL的RPMI-1640(含体积分数0.20 FBS),置于培养箱中培养24 h。弃上层液体,以PBS清洗2次,用棉签拭去上室内的细胞,将小室置于多聚甲醛固定液中固定20 min,弃去固定液。清洗后将小室置于1 g/L结晶紫染液中染色15 min,再次清洗并晾干,放于显微镜下拍照计数。检测侵袭能力时,先将Matrigel基质胶与RPMI-1640培养液以1∶20均匀混合后,向上室内每孔加入100 μL混合液,置于培养箱中过夜。其他条件同迁移能力检测。

1.3 统计学方法

采用Graph Pad Prism 8.0.2软件进行统计学分析。Western blot检测所得的平均灰度值比值及TranswellTM实验所得的细胞数均以x±s表示,两组均数比较采用t检验;多组均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用Tukey检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生物信息学分析

对提取的GEO数据库数据进行分析,结果显示,肺腺癌组织中METTL5的表达显著高于癌旁正常肺组织,差异具有统计学意义(P<0.05)(图1A)。使用GEPIA绘制Kaplan-Meier曲线,分析结果显示,METTL5表达水平高的病人具有更短的生存期(P<0.05)(图1B)。

A:METTL5在肺腺癌组织和癌旁正常组织中的表达;B:METTL5表达与肺腺癌病人生存之间的关系。

2.2 METTL5在肺腺癌细胞系中的表达

Western blot检测结果表明,BEAS-2B、A549及H1975细胞中METTL5蛋白表达水平差异具有统计学意义(F=16.53,P<0.05)。与BEAS-2B细胞相比,A549及H1975细胞中METTL5蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);而A549细胞和H1975细胞中METTL5蛋白表达水平差异无统计学意义(P<0.05)(图2)。

A:3种细胞系中METTL5蛋白表达的Western blot检测;B:3种细胞系METTL5蛋白相对表达量比较。

2.3 敲低METTL5表达对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响

为研究METTL5在肺腺癌细胞中的作用,使用慢病毒敲低A549及H1975细胞中METTL5基因(图3A)。Western blot检测显示,METTL5敲低后shMETTL5组两种细胞METTL5蛋白表达水平较Control组显著下调(t=8.403、4.222,P<0.05)(图3B、C)。细胞迁移和侵袭实验结果显示,METTL5敲低后shMETTL5组两种细胞迁移细胞数和侵袭细胞数均较Control组明显减少(t=7.803～14.430,P<0.05),表明METTL5显著促进A549、H1975细胞的迁移、侵袭(图3D～G)。

A:慢病毒转染后荧光效果图;B:A549和H1975细胞的METTL5蛋白表达;C:慢病毒转染后各组细胞METTL5蛋白相对表达量;D:TranswellTM迁移实验用于验证两种肺腺癌细胞(A549、H1975)的迁移能力(结晶紫染色);E:A549和H1975细胞迁移能力的半定量分析;F:TranswellTM侵袭实验用于验证两种肺腺癌细胞(A549和H1975)的侵袭能力(结晶紫染色);G:A549和H1975细胞侵袭能力的半定量分析。

2.4 敲低METTL5对肺腺癌细胞Vimentin和E-Cadherin表达的影响

本文Western blot检测结果显示,Control组和shMETTL5组两种肺腺癌细胞Vimentin蛋白表达差异具有显著性(F=155.40,P<0.05);与Control组相比,shMETTL5组两种肺腺癌细胞Vimentin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。Control组和shMETTL5组两种肺腺癌细胞E-Cadherin蛋白表达差异具有显著性(F=73.75,P<0.05);与Control组相比较,shMETTL5组两种肺腺癌细胞的E-Cadherin蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图4。

A:各组两种细胞Vimentin和E-Cadherin蛋白表达的Western blot检测;B:各组两种细胞Vimentin和E-Cadherin蛋白相对表达量比较。

3 讨 论

近年来随着肺癌筛查手段、靶向及免疫治疗的不断进步,肺癌病人的生存不断改善,但肺癌病人死亡数仍高居恶性肿瘤死亡数之首,且转移和复发的肺癌病人预后更差[8-9]。到目前为止,手术仍然是根治早期肺癌的唯一方法[10]。随着分子生物学及靶向治疗的发展,针对kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因(Kras)、表皮生长因子受体(EGFR)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、c-ros肉瘤致癌因子-受体酪氨酸激酶(ROS1)等靶点突变及程序性死亡受体1(PD-1)/程序性死亡受体-配体1(PD-L1)通路的新型靶向药物层出不穷,肺癌的治疗取得了长足进步[11-14]。但肺腺癌的靶向治疗仍处于发展阶段,因此寻找肺腺癌治疗的新靶点具有重要意义。

m6A RNA甲基化作为一种表观遗传修饰方式,是真核生物中最丰富的RNA修饰[15]。该修饰早在20世纪70年代就被发现,但其确切功能和调控机制在很大程度上仍然不清楚[6]。研究发现,m6A修饰在各种RNA中均丰富而保守,表明它能够广泛调控基因表达[16-17]。随着研究的深入,m6A修饰在肺腺癌进展中的作用及机制也逐渐被揭示。YIN等[18]发现,线粒体RNA核糖核酸内切RNA组分(RMRP)在NSCLC中高表达,METTL3通过提高RMRPRNA的m6A水平增强其稳定性,通过调节转化生长因子β受体1(TGFBR1)/SMAD蛋白2(SMAD2)/SMAD蛋白3(SMAD3)途径促进NSCLC进展。因此,识别m6A相关基因、阐明它们在肺腺癌发生发展中的作用及调控机制对于肺腺癌治疗至关重要。

METTL5是m6A甲基转移酶家族中新发现的一个成员,与其他家族成员参与mRNA甲基化修饰不同,METTL5可以与tRNA甲基转移酶112(TRMT112)结合形成异二聚体以获得代谢稳定性,负责18S rRNA 1832位腺苷甲基化[19]。RONG等[20]应用公开数据库及乳癌样本分析METTL5表达与乳癌病人生存之间的关系,结果显示乳癌病人METTL5高表达与较差的生存之间存在显著相关性。METTL5基因敲除的乳癌细胞中多聚核糖体形成减少,细胞整体翻译能力减弱,细胞周期发生停滞,细胞凋亡增加,表明METTL5可促进乳癌细胞生长。HUANG等[21]研究发现,METTL5可通过调节c-Myc水平提高胰腺癌细胞迁移、侵袭能力从而促进胰腺癌恶性进展。PENG等[22]的研究表明,METTL5通过靶向酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)促进肝细胞肝癌(HCC)细胞从头脂肪生成并导致游离脂肪酸水平增加,使HCC细胞发生代谢重编程而促进HCC进展。然而,METTL5在肺腺癌中发挥的作用仍不清楚。我们在前期生物信息学分析中,通过对TCGA数据库中肺腺癌的差异表达mRNA进行分析,筛选出与肿瘤分期相关枢纽基因METTL5,首次发现METTL5在肺腺癌组织中高表达并与肺腺癌病人的不良预后显著相关。本研究结果显示,METTL5在肺腺癌细胞系中的表达水平明显高于正常肺上皮BEAS-2B细胞系,提示METTL5在肺腺癌中发挥促癌作用。为进一步探究METTL5在肺腺癌中的作用,本研究使用shMETTL5慢病毒转染肺腺癌A549和H1975细胞系,检测肺腺癌细胞的行为。体外细胞实验结果显示,转染shMETTL5的肺腺癌细胞迁移、侵袭能力显著降低,表明敲低METTL5基因能明显抑制肺腺癌的进展。

EMT过程与癌症进展密切相关,EMT发生时上皮细胞形态改变,细胞间连接消失,细胞失去极性转变为具有转移和侵袭能力的间质细胞,促进肿瘤的转移与复发并使肿瘤细胞表现出明显的治疗抗性[23-24]。EMT过程中细胞发生了特征性的分子变化,具体表现为上皮标记物E-Cadherin表达降低,间质标记物Vimentin表达上调[25-26]。本文研究结果显示,敲低METTL5基因表达能够显著抑制肺腺癌细胞的EMT,表明METTL5通过促进肺腺癌细胞EMT进程促进肺腺癌进展。在后续研究中我们将探讨METTL5促进肺腺癌细胞EMT进程的具体分子机制。

综上所述,METTL5在肺腺癌中高表达,其表达水平与病人预后呈明显负相关;敲低METTL5基因表达可显著抑制肺腺癌细胞迁移、侵袭,其机制可能是METTL5促进肺腺癌细胞EMT进程。本研究结果表明,METTL5可能在肺腺癌进展中发挥重要作用。因此,METTL5有望成为肺腺癌治疗的潜在靶点及评估肺腺癌发生发展的重要标志物。