血卟啉衍生物在3种肺癌细胞系中的细胞摄取和定位

马亿江,丁晓倩,隋爱华,杨晓晖,曹艺巍,林存智

(青岛大学附属医院,山东 青岛 266555 1 呼吸与危重症医学科; 2 医学研究中心)

在中国,肺癌是最常见的癌症事件,也是癌症死亡的主要原因[1-2]。光动力疗法(PDT)作为一种有前景的、非侵入性的癌症治疗方式,在近几十年广泛用于肺癌的治疗。PDT由3个基本成分组成,即光、氧和光敏剂(PS)[3-4]。血卟啉衍生物(HPD)存在化学纯度低、组织穿透性差、半衰期长等缺点,但到目前为止仍是最常用、且是唯一一种被FDA批准用于多种实体恶性肿瘤临床治疗的PS[5-6]。PS的细胞摄取、胞内分布是决定PDT功效的重要因素[7]。实体肿瘤由多种具有不同PS摄取特性的细胞组成。因此,细胞水平的药代动力学是优化PDT效果的一个重要参数[8]。本实验以人支气管上皮BEAS-2B细胞作对照,选取3种肺癌细胞系如人肺腺癌A549、人肺鳞癌H520、人肺小细胞癌H446细胞进行研究,在体外通过多功能酶标仪、流式细胞仪、激光扫描共聚焦显微镜等仪器检测细胞内荧光强度,比较分析HPD在4种细胞内的摄取、定位差异,以期为针对不同的肺癌类型选取特定方案(特定的PS注射浓度和时间)来增强HPD介导的PDT疗效提供一定的指导。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

HPD由重庆迈乐生物制药有限公司生产,规格为5 mL:25 mg;在超净工作台分装后于-20 ℃冰箱避光保存,用含体积分数0.10胎牛血清和体积分数0.01青霉素/链霉素双抗溶液的DMEM高糖完全培养液现配现用。DMEM高糖培养液、胰蛋白酶、青霉素/链霉素双抗溶液及40 g/L多聚甲醛固定液均购于大连meilunbio公司,胎牛血清购于武汉Procell公司,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、抗荧光淬灭封片液购于北京Solarbio公司。

1.2 细胞培养

人肺腺癌A549细胞系购于美国菌种保藏中心(ATCC),人支气管上皮BEAS-2B细胞系、人肺鳞癌H520细胞系、人肺小细胞癌H446细胞系均购于武汉Procell公司,于青岛大学附属医院中心实验室液氮罐中保存。4种细胞系均使用含体积分数0.10胎牛血清和体积分数0.01青霉素/链霉素双抗溶液的DMEM高糖完全培养液,于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的饱和湿度孵箱中培养。

1.3 绘制HPD荧光值的标准曲线

取96孔板,将HPD浓度设为5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mg/L,每个浓度设3个复孔,应用多功能酶标仪检测不同浓度HPD的荧光值(激发波长为405 nm,发射波长为630 nm),取其平均值,从低浓度开始绘制标准曲线。

1.4 多功能酶标仪检测4种细胞系对HPD的摄取

将4种细胞以每孔104个细胞的密度接种于5块96孔板中,每组设4个复孔,12 h后随机分为对照组(无HPD孵育)和实验组(用HPD孵育不同时间)。实验组加入5 mg/L的HPD,分别于培养箱内继续避光培养4、8、12、24、48 h,后弃去未结合HPD,加入完全培养液后用多功能酶标仪检测荧光强度,激发波长为405 nm,发射波长为630 nm。

1.5 流式细胞仪检测4种细胞系对HPD的摄取

将4种细胞以每孔105个细胞的密度接种于12孔板中,至12 h细胞贴壁以后随机分为对照组(无HPD孵育)和实验组(用HPD孵育不同时间)。实验组加入5 mg/L的HPD,于培养箱内继续避光培养24、48 h,后弃去未结合HPD。两组均用PBS洗2次后收集细胞,以PBS重悬,各取400 μL(每组细胞总数为105个),过滤后用流式细胞仪检测细胞荧光强度。

1.6 激光扫描共聚焦显微镜观察4种细胞系HPD的细胞定位

将盖玻片用体积分数0.75的乙醇浸泡、培养液冲洗后置于24孔板中,4种细胞以每孔104个细胞的密度接种,12 h后随机分为对照组(无HPD孵育)和实验组(用HPD孵育)。实验组加入15 mg/L的HPD,于培养箱内继续避光培养48 h,后弃去未结合HPD,用40 g/L多聚甲醛常温固定20 min,PBS洗3次后用DAPI避光染8 min,以PBS洗3次。将染色好的盖玻片盖于滴有抗荧光淬灭封片液的载玻片上并封片,于激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 HPD荧光值标准曲线绘制

利用5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mg/L HPD测得的荧光值绘制标准曲线(图1),同时做相关回归分析,得回归方程Y=2 276×X+17 563(式中Y表示荧光强度,X表示浓度),相关系数r=0.992 0,P=0.000 9,95%CI=(0.878 7～0.999 5)。结果表明,在一定浓度范围内HPD浓度与荧光强度呈正相关,可以用HPD的荧光强度来代表HPD含量。

图1 HPD荧光值的标准曲线

2.2 多功能酶标仪检测4种细胞系对HPD的摄取

将5 mg/L HPD与4种细胞分别共孵育4、8、12、24、48 h,多功能酶标仪检测荧光强度,绘制时间依赖曲线(图2)。如图2所示,4种细胞系的HPD时间依赖曲线总体呈现上升的趋势,表明随着时间增加细胞摄取HPD增加。4种细胞系摄取HPD在4、8、12 h无明显增加,BEAS-2B、A549、H446细胞在12 h之后HPD迅速积累,H520细胞则出现一定的延缓,在24 h后才表现出摄取速率的加快。

图2 4种细胞系摄取HPD的时间依赖曲线

BEAS-2B(a)、A549(b)、H520(c)、H446(d)细胞分别与HPD共孵育24、48 h,流式细胞仪检测细胞内HPD荧光强度;4种细胞系在24、48 h时的HPD摄取差异(e)。*、#:P<0.05;**、##:P<0.01;***、###:P<0.001。*:对照组与摄取HPD 24 h比较;#:摄取HPD 24 h与摄取HPD 48 h比较。

2.3 流式细胞仪检测4种细胞系对HPD的摄取

为了排除细胞增殖差异的影响,进一步量化细胞摄取,对5 mg/L HPD孵育24、48 h的细胞进行流式细胞仪检测。结果显示,4种细胞在24、48 h表现出很强的荧光信号,表明HPD在细胞内高效累积,且48 h累积量高于24 h。随着孵育时间延长细胞摄取HPD增加,但4种细胞系在48 h均未达到摄取饱和。见图3。HPD孵育24、48 h时,4种细胞内平均荧光强度差异具有统计学意义(F=199.00、71.15,P<0.001),其中A549细胞内HPD平均荧光强度显著高于H446、BEAS-2B、H520细胞,H446和BEAS-2B细胞内平均荧光强度显著高于H520细胞(P<0.05),而H446和BEAS-2B细胞内平均荧光强度差异无统计学意义(P>0.05)。所以,A549细胞摄取HPD的能力最强,BEAS-2B细胞和H446细胞次之,H520细胞摄取HPD的能力最弱。见图4。

HPD共孵育24 h(a、b)和48 h(c、d),流式细胞仪检测4种细胞系之间的摄取差异。*、#、△:P<0.05;**、##、△△:P<0.01;***、###、△△△:P<0.001。*、ns:与BEAS-2B实验组比较;#:与A549实验组比较;△:与H520实验组比较。

2.4 HPD在4种细胞内的定位

本文激光扫描共聚焦显微镜观察结果显示,与15 mg/L HPD共孵育48 h后,4种细胞系的实验组细胞内呈现出强度不等的红色荧光信号,均呈点状分布于细胞质内,而在对照组几乎观察不到。表明4种细胞系摄取HPD定位于细胞质中,且分布未观察到明显差异。见图5。

红色表示HPD荧光,蓝色表示DAPI荧光,比例尺=25 μm。

3 讨 论

PDT治疗的原理是PS在符合其吸收光谱的光波长照射下,吸收光子的能量转移给氧分子,产生超氧阴离子、单线态氧等细胞毒性活性氧(ROS),导致氧化应激进而破坏肿瘤细胞。单线态氧的寿命极短(10～320 ns),其在细胞内的扩散范围仅为10～55 nm,因此PDT的效果在一定程度上取决于所使用PS的细胞内分布、定位[6,9-10]。PS的细胞摄取、细胞内分布和滞留取决于PS的化学性质、PS浓度、孵育时间以及细胞特性,包括细胞体积、增殖状态、细胞内靶位点与PS结合的亲和力以及细胞类型等[7,11]。

已知一个特定的细胞类型有它自己的PS吸收和清除的比例(即细胞动力学特征)。早在1990年PERRY等[12]就研究证明了Photofrin Ⅱ的细胞摄取在不同细胞系间有所差异。随后FICKWEILER等[13]的实验研究证明了另外一种PS(ATMPn)在皮肤细胞系之间的细胞摄取差异。CHWIKOW-SKA等[14]在2003年研究显示,Photofrin Ⅱ在不同肿瘤细胞(乳腺腺癌MCF7细胞和白血病T细胞淋巴瘤Jurkat细胞)之间存在着摄取差异。本研究探讨临床上应用的HPD(喜泊分)在不同组织学类型肺癌细胞中摄取的差异性。多功能酶标仪检测结果显示,支气管上皮BEAS-2B细胞、肺腺癌A549细胞、肺小细胞癌H446细胞与HPD共孵育12 h后,HPD迅速累积,而肺鳞癌H520细胞摄取HPD速率缓慢,在24 h后摄取加快。由于多功能酶标仪检测的是细胞总的荧光强度,所以在24、48 h进一步用流式细胞仪量化细胞内平均荧光强度,结果显示,4种细胞48 h的细胞内平均荧光强度均高于24 h。以上结果表明,随着时间增加4种细胞系摄取HPD的速率不同,也进一步证实细胞类型不同,其PS摄取存在差异。

本实验中细胞与HPD共孵育48 h后,肺腺癌A549细胞内的平均荧光强度甚至达到了肺鳞癌H520细胞的2倍,肺小细胞癌H446细胞内荧光强度也远高于肺鳞癌H520细胞,表明不同类型的肺癌细胞之间HPD摄取存在差异。可能随着孵育时间的延长,细胞的增殖状态影响了PS的摄取。此外,也可能是由于在HPD孵育初期,HPD更多地定位于线粒体,随后在溶酶体中表现出时间依赖性的摄取[15]。这也解释了本研究4种细胞与HPD共孵育4、8、12、24、48 h细胞内HPD荧光强度随着时间延长而增强的现象。

PS的特性之一是选择性靶向肿瘤组织[16]。有研究发现,肿瘤细胞中HPD的摄取量甚至比相应组织的正常细胞高5倍[17]。然而本研究结果显示,正常支气管上皮BEAS-2B细胞内HPD的摄取量高于肺鳞癌H520细胞,与肺小细胞癌H446细胞相比无统计学差异;虽然肺腺癌A549细胞内HPD的摄取量高于正常支气管上皮BEAS-2B细胞,但远不到5倍。1990年,PERRY等[12]的实验也表明,正常肺纤维母细胞CCL-210细胞内PS的浓度高于肺癌细胞。这可能是由于体内体外实验条件差异所引起,在体内情况下,多种因素可能促进HPD对肿瘤组织的高选择性。可能因素包括:肿瘤组织中的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)水平高于正常组织[18];与正常组织相比,肿瘤毛细血管相对高的渗透性和扩散作用[19];肿瘤组织存在增强渗透性和保留效应[20]。也有研究表明,在体外单独肿瘤细胞中PS的累积并不是都高于正常组织来源的细胞[21]。

PS在细胞内的定位对于确定PS的靶点很重要,而PS的靶点可能决定了PDT产生光动力损伤的位点和程度,并且决定了细胞死亡的途径和类型[22-23]。卟啉主要通过被动扩散、与脂蛋白结合以及与外周苯二氮受体结合等方式在细胞中累积,定位于线粒体、溶酶体、内质网、高尔基体、核膜等细胞膜结构,在细胞中发出弥漫性荧光[24-26]。本研究在激光扫描共聚焦显微镜下观察4种细胞系HPD的细胞内定位,结果显示,HPD在细胞质内弥漫性分布,并未观察到明显的分布差异,其亚细胞定位是否有差异需进一步研究。

综上所述,在体外控制一定条件的情况下,不同的人肺癌细胞系摄取HPD存在差异,HPD的细胞摄取能力肺腺癌A549细胞>肺小细胞癌H446细胞>肺鳞癌H520细胞。然而是否所有的肺腺癌细胞均具有高HPD摄取能力,以及HPD细胞摄取与组织学分型的相关性,还需要进一步研究验证。未来将在本实验的基础上选用动物移植瘤模型、类器官模型等模拟体内环境,探究HPD对肿瘤组织高选择性的机制。